卵巢切除對大鼠關節內骨折后軟骨愈合的影響

王 磊 李曉林

卵巢切除對大鼠關節內骨折后軟骨愈合的影響

王 磊 李曉林

目的探討骨質疏松對大鼠關節內骨折后軟骨愈合的影響。方法16只4.5月齡的雌性SD大鼠分為兩組，實驗組行雙側卵巢切除，對照組施行假手術。10周后，經手術制造右脛骨平臺內髁劈裂骨折，克氏針交叉內固定。術后大鼠自由活動，6周后全部處死，標本行大體和組織學觀察。結果所有標本骨折均愈合。實驗組脛骨平臺內側關節軟骨多不平整伴輕度塌陷，軟骨裂隙依稀可辨，色澤稍暗；對照組內側關節軟骨多平整光滑，軟骨裂隙消失。HE染色光鏡觀察發現，實驗組關節軟骨裂隙處可見較多纖維組織，透明樣軟骨呈島狀散在分布于關節表面；對照組多為透明樣軟骨，細胞排列較規則，但未見明顯分層及潮線。結論卵巢切除導致大鼠骨質疏松，延緩了關節內骨折后軟骨愈合的進程，且軟骨愈合質量較差。

骨質疏松骨軟骨骨折卵巢切除術

隨著社會人口的日趨老齡化，臨床上合并骨質疏松的關節內骨折病例也日益增多，其治療較為棘手。近年來的研究提示，絕經后婦女體內雌激素水平低下，在發生骨質疏松的同時，其關節內軟骨易發生退變。然而，對于骨質疏松同時伴發關節內骨折的愈合過程，相關研究報道較少。

本實驗將大鼠雙側卵巢切除后，建立脛骨平臺骨折模型，初步探討骨質疏松癥對關節內骨折后軟骨愈合過程的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型

選用4.5月齡，體重280～310 g雌性SD大鼠共16只（上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供），其中實驗組（8只）行雙側卵巢切除，10周后經雙能X線骨密度儀（HOLOGIC，QDR－4000）測量，證實實驗組已發生骨質疏松。此時，實驗組與對照組均行右膝下髕旁內側切口，并顯露脛骨平臺內側髁，于其內外1/2處的關節軟骨下方1 cm范圍用直徑0.6 mm克氏針作郵票打孔，鉆透前后骨皮質，11號尖刀片銳性切割軟骨面并貫通軟骨下孔洞，造成外側皮質連續的脛骨平臺內側髁垂直劈裂骨折，骨折間隙約1～2 mm，隨后在距關節面下0.5 mm處用兩根直徑0.8 mm克氏針由內向外作平行關節面的交叉內固定，尾端折彎埋于皮下（圖1）。大鼠籠內飼養，術前30 min起，肌注青霉素鈉鹽（每公斤體重注射15萬單位），連續3 d，術后自由活動。

1.2 觀察指標

所有大鼠于造模6周后腹腔過量注射氯氨酮致死，將右脛骨平臺取出后行大體觀察。小心取出克氏針，標本用4%的多聚甲醛溶液（pH 7.4）固定24 h，10%EDTA溶液脫鈣2～3周，石蠟包埋，冠狀面切片，HE染色觀察。

2 結果

2.1 大體觀察

所有大鼠均未出現傷口感染，6周后順利取材。膝關節離斷時觀察到關節內有不同程度粘連，標本取出后發現脛骨平臺軟骨及軟骨下骨骨折均已愈合。

實驗組脛骨平臺內側關節軟骨輕度塌陷，關節面呈彈格子路樣坑坑洼洼，多不平整且色澤蒼白，軟骨裂隙依稀可辨（圖2）；相比之下，對照組關節面多平整光滑無塌陷，色澤較光亮，軟骨裂隙消失（圖3）。

圖1 大鼠脛骨平臺內側骨折的動物模型

圖2 實驗組關節面高低不平，蒼白有裂隙

圖3 對照組關節面平整光滑，且光亮

2.2 組織學觀察

石蠟切片HE染色后光鏡下觀察發現，實驗組關節軟骨裂隙處可見數個團簇狀軟骨樣組織充填，與周圍正常軟骨組織不連接，其中軟骨細胞數量少且呈不規則聚集排列，其間有少量纖維組織間隔，關節表面多見軟骨剝脫，軟骨下骨板構建延緩（圖4）。對照組多見透明樣軟骨形成，平整移行于軟骨裂隙邊緣，軟骨細胞數量明顯增多且排列較規則，但未出現明顯分層，潮線消失，關節表面未見軟骨剝脫，軟骨下原始骨小梁形成較多（圖5）。

圖4 實驗組軟骨樣組織團簇樣排列，軟骨細胞少（HE，100×）

圖5 對照組透明樣軟骨形成，軟骨細胞多且排列規則（HE，40×）

3 討論

3.1 雌激素缺乏影響關節內骨折修復的動物模型的建立

臨床常見的關節內骨折多累及軟骨下骨，即骨軟骨骨折，其修復過程和局限于關節軟骨內的單純軟骨損傷修復截然不同。由于骨折穿透軟骨下骨，導致出血，纖維蛋白凝塊充填骨折端，局部產生的炎性反應使骨髓中的間充質細胞趨化聚集，并在周圍各種生長因子和局部微環境的作用下，特定地向成骨或成軟骨分化，最終形成骨和軟骨組織。而影響該過程的因素較多，包括骨折個體本身的年齡大小、損傷過程的機械刺激和修復的應力環境、損傷區域的范圍和大小及內固定的穩定性等。

成年大鼠雙側卵巢切除已被作為經典的雌激素缺乏導致的骨質疏松動物模型，脛骨近端更是研究骨質疏松的代表部位，而位于脛骨平臺內側中點的關節內骨折能較好地模擬臨床骨折修復的應力刺激。Shapiro等[1]在兔的股骨關節面上鉆孔，深達軟骨下骨，認為直徑3 mm的鉆孔，可以被新生透明軟骨修復，而大于此直徑的則不能自然修復。本實驗采用郵票打洞后手術刀片銳性切割造模，骨折間隙小于3 mm，對照組實驗結果證實，6周后也可觀察到新生的透明樣軟骨形成。

Mitchell等[2]在成年兔股骨內髁制造關節內骨折，分別用拉力螺釘給予骨折塊間不同的加壓固定，結果發現軟骨間隙在加壓穩定的條件下，修復組織為透明軟骨，未加壓則導致纖維軟骨的形成。Plaga等[3]在兔的股骨內髁前方制造關節內剪切樣骨折，采用克氏針交叉固定后6周，發現骨折塊固定穩定，骨折愈合，移位均小于1 mm。本實驗在制作脛骨平臺骨折時，骨折塊之間尚留有完好的內側皮質連接支撐，兼用交叉克氏針做內固定，提供了較好的內固定穩定性，因此能在對照組觀察到了正常的軟骨修復過程。

綜合考慮上述各因素，本課題組認為，大鼠雙側卵巢切除后的脛骨平臺骨折操作簡便，骨軟骨修復過程穩定可靠，可以用來研究雌激素缺乏對關節內骨折愈合過程的影響。

3.2 雌激素缺乏對關節內骨折軟骨愈合的影響

Genesan等[4]研究發現，對卵巢切除大鼠使用雌激素后，可以有效緩解關節軟骨的膠原降解。高峰等[5]分別對卵巢切除大鼠使用雌激素及雌激素受體調節劑，也發現尿中CTX-Ⅱ的代謝峰顯著降低，同時關節軟骨面的病損程度明顯好轉。上述研究均表明，雌激素水平影響著關節軟骨的代謝。Oshima等[6]對不同周齡、性別以及去勢大鼠的髖關節軟骨做免疫熒光染色，發現雌激素受體（Estrogen receptor，ER）表達于成年大鼠關節軟骨及軟骨下骨中，且均分布在關節軟骨細胞的胞漿和胞核中，提示了雌激素可以直接通過其受體介導關節軟骨的代謝。同時發現，雄性幼年及老齡大鼠的ER表達水平無明顯差異，但卵巢切除大鼠ER兩種亞型（ER-α和ER-β）表達以及老年雌性大鼠的ER-α表達水平均有下降，提示了雌激素水平的降低也會導致軟骨細胞中ER數量和功能的改變，從而進一步影響軟骨的代謝。

關節軟骨全層骨折的修復過程主要由骨髓來源的間充質干細胞在局部募集，通過各種因子誘導分化最終形成軟骨細胞而完成。這些因子包括離子，低分子量復合物如類固醇激素，多肽激素，以及蛋白等，其中部分是由軟骨外組織傳遞（旁分泌作用），但許多是由軟骨細胞自分泌并起介導作用。Wang等[7]取成年雌性大鼠的骨髓基質干細胞做體外培養，運用免疫組花和RT-PCR觀察ER-α的數量和分布，發現在胞核內出現一過性的波峰樣表達，認為雌激素可能在調節干細胞分化階段起一定的介導作用。此外，Takeuchi等[8]在軟骨細胞體外培養過程中，檢測到作為性類固醇激素前體的mRNA表達，提示了軟骨細胞還可能通過自分泌介導激素類因子的作用。

本實驗中，卵巢切除大鼠的關節軟骨及軟骨下骨愈合延緩，提示了雌激素缺乏延緩了關節內骨折愈合過程，而形成的軟骨樣組織外觀高低不平且色澤蒼白，鏡下顯示軟骨細胞無規則排列，軟骨外基質雜亂，提示了關節內骨折的愈合質量明顯降低，其內在的調控機理尚有待進一步深入探討。

[1]Shapiro F,Koide S,Glimcher MJ.Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage[J].J Bone Joint Surg Am,1993,75:532-553.

[2]Mitchell N,Shepard N.Healing of articular cartilage in intra-articular fractures in rabbits[J].J Bone Joint Surg Am,1980,62:628-634.

[3]Plaga BR,Royster RM,Donigian AM,et al.Fixation of osteochondral fractures in rabbit knees.A comparison of Kirschner wires,fibrin sealant,and polydioxanone pins[J].J Bone Joint Surg Br,1992, 74:292-296.

[4]Ganesan K,Tiwari M,Balachandran C,et al.Estrogen and testosterone attenuate extracellular matrix loss in collagen-induced arthritis in rats[J].Calcif Tissue Int,2008,83:354-364.

[5]高峰,杜寧.藥物干預對去卵巢大鼠關節軟骨代謝的影響[J].中國骨傷,2008,21:196-199.

[6]Oshima Y,Matsuda K,Yoshida A,et al.Localization of estrogen receptors α and β in the articular surface of the rat femur[J]. Acta Histochem Cytochem,2007,40(1):27-34.

[7]Wang Q,Yu JH,Zhai HH,et al.Temporal expression of estrogen receptor alpha in rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,347:117-123.

[8]Takeuchi S,Mukai N,Tateishi T,et al.Production of sex steroid hormones from DHEA in articular chondrocyte of rats[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,293;E410-E415.

Histological Observation on the Healing of Osteochondral Fracture in Ovariectomized Rats

WANG Lei,LI Xiaoling.
Department of Orthopaedic Surgery,Shanghai Sixth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200233,China.

ObjectiveTo explore the healing process of osteochondral fracture in ovariectomized rats.MethodsSixteen female SD rats with a mean age of 4.5 months were involved in the study,eight of which underwent bilateral ovariectomy (OVX),while the others underwent sham operation(SHAM).Ten weeks later when the osteoporosis was confirmed,all the rats were suffered tibial plateau fracture(SchatzkerⅣ)in right hind limb and fixed with two Kirschner wires in the same time. The rats were sacrificed on 6 weeks after fracture,and the fractured tibial plateaus were taken for gross and histological observation.ResultsAll the fractures healed completely.The cartilage in medial side of tibial plateau in OVX rats was uneven and collapsed,and fracture line was obscure.On histological observation,there were fibrous tissue with scattered hyaline-like cartilage inside.In SHAM rats,the cartilage was congruity and smoothly,fracture line was almost disappeared. There was hyaline-like cartilage instead,with chondrocytes aligned regularly but no tidemark appeared.ConclusionIn ovariectomized rats,the process of the osteochondral fracture healing was delayed because of osteoporosis.

Osteoporosis;Osteochondral fracture;Ovariectomy

R711.75

A

1673－0364（2009）－01－0035－03

2008年12月25日；

2009年1月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.010

200233上海市上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院骨科。