人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其與膠原支架材料的相容性

王 琦 刁垠澤 馬慶軍

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其與膠原支架材料的相容性

王 琦 刁垠澤 馬慶軍

目的探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs）體外分離、培養(yǎng)的方法，觀察其與膠原蛋白支架的相容性，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。方法利用組織體外培養(yǎng)法分離人臍帶MSCs，流式細(xì)胞學(xué)分析細(xì)胞表型，組織化學(xué)觀察細(xì)胞分化能力；將細(xì)胞靜態(tài)接種于膠原蛋白支架上，觀察細(xì)胞在材料中的形態(tài)、粘附情況和增殖特點(diǎn)。結(jié)果直接貼壁法分離的細(xì)胞表型均一，體外具有成骨和成脂肪能力；細(xì)胞在支架上有較好的粘附鋪展，培養(yǎng)2周后，MSCs占據(jù)支架總體積的80%，細(xì)胞分布較均勻。結(jié)論組織塊培養(yǎng)法可獲得高純度的人臍帶MSCs，細(xì)胞在體外與膠原蛋白有較好的組織相容性。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原蛋白生物支架相容性

組織工程細(xì)胞－支架復(fù)合物至少包括兩個重要組成部分，即活細(xì)胞和支架材料，其中活細(xì)胞是產(chǎn)生新組織的決定性成分，是構(gòu)建組織工程復(fù)合體的關(guān)鍵因素，因此尋找再生能力強(qiáng)的種子細(xì)胞和適合細(xì)胞生存的生物材料便成為組織工程研究的核心內(nèi)容[1]。本研究以人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，觀察其在牛膠原蛋白支架上的貼附、生長和分化情況，證明兩者可以形成細(xì)胞－支架復(fù)合物。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離自產(chǎn)婦臍帶，Ⅱ型膠原蛋白購買自北京貝菱公司，是將18個月齡的健康牛跟腱通過酶解獲得，DMEM培養(yǎng)基采用市售產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）的培養(yǎng)

將臍帶剪切成4～5 cm長的小段，擠凈血管內(nèi)血液，用眼科剪沿血管將包裹著血管的Wharton膠剪下，于小培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)一步剪碎。將組織小塊收集于50 mL離心管內(nèi)，每次加入5倍以上體積的PBS，反復(fù)清洗2～3次，室溫下160 g離心8 min。清洗后的組織小塊種植于100 mm培養(yǎng)皿，加入含10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基，在37℃、飽和溫度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔2日更換培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)到80%匯合時更換新鮮培養(yǎng)液，次日去除培養(yǎng)液后以37℃預(yù)熱的PBS輕柔沖洗細(xì)胞，棄去PBS后加入適量胰酶-EDTA，光鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)胞質(zhì)回縮、胞體變圓時棄去胰酶，以含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基輕柔吹打細(xì)胞使之脫落，將細(xì)胞懸液離心清洗兩次，計數(shù)，依細(xì)胞數(shù)量接種于新的培養(yǎng)瓶。

1.2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定

取第4代生長狀態(tài)良好細(xì)胞，消化并計數(shù)，用含2%胎牛血清的冷FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，以每管2×105個細(xì)胞分裝，分別加入以下抗體（按說明書推薦用量）：小鼠抗人CD29-FITC，CD34-FITC，CD45-FITC，CD71-FITC，CD90-FITC，CD117-FITC；CD80-PE，CD86-PE，CD105-PE，HLA-A、B、C-PE，CD73-PE；CD14-PE，CD44-PE，HLA-DP、DQ、DR-PE。分別以小鼠IgG1-FITC、小鼠IgG1-PE、小鼠IgG2a-PE作為同型對照，4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌2次，每管加入200 μL流式細(xì)胞儀固定液，輕柔吹打成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測。

1.3 體外分化實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[2]報道方法進(jìn)行MSCs體外成骨和成脂肪能力鑒定，NBT-BCIP染色顯示堿性磷酸酶活性，油紅染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪滴。

1.4 支架與細(xì)胞共培養(yǎng)

將膠原蛋白支架材料置入24孔培養(yǎng)板中，每孔各一塊，取消化后體外培養(yǎng)的第6代細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度2×106cells/mL，每孔接種2 mL，并浸沒支架，次日更換培養(yǎng)液，每日使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞與生物材料附著及生長等情況。

1.5 組織化學(xué)分析

植入2周后，取出標(biāo)本，以10%中性福爾馬林固定，制備石臘切片，HE染色，觀察組織在支架材料內(nèi)的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況

接種后7～12 d可見細(xì)胞從組織塊爬出，呈成纖維細(xì)胞樣，約2周時細(xì)胞達(dá)到80%匯合，可進(jìn)行傳代，傳代后2～3 h貼壁，4～6 d長滿，細(xì)胞匯合成單層細(xì)胞，生長旺盛（圖1）。

2.2 hUC-MSCs的培養(yǎng)、鑒定

第4代細(xì)胞的流式分析表明，培養(yǎng)的MSCs樣細(xì)胞表達(dá)CD29，CD73，CD105，CD166，HLA-A、B、C（MHC-Ⅰ）；不表達(dá)CD31（內(nèi)皮細(xì)胞抗原），CD34（造血干細(xì)胞抗原），CD45（白細(xì)胞共同抗原），和HLA-DR（MHC-II）。

進(jìn)一步研究表明，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后高表達(dá)堿性磷酸酶活性，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴。證明細(xì)胞具備成骨和成脂肪能力，提示所得貼壁細(xì)胞為MSCs（圖2）。

2.3 相差顯微鏡鏡下結(jié)果

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與支架共培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下大部分細(xì)胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形等，黏附于膠原蛋白細(xì)胞支架上，膠原蛋白與細(xì)胞有良好的相容性，在膠原蛋白的邊緣可見明顯的細(xì)胞長入，細(xì)胞對支架材料有良好的趨向性（圖3）。

2.4 蘇木精-伊紅染色結(jié)果

在混合培養(yǎng)中支架與細(xì)胞相容性良好，細(xì)胞在材料中粘附良好，呈棱形和多角形生長。細(xì)胞與支架材料有趨向性，在支架材料的邊緣明顯可見細(xì)胞長入，膠原蛋白的多孔結(jié)構(gòu)非常有利于細(xì)胞長入。在膠原蛋白纖維上有細(xì)胞密集區(qū)，細(xì)胞核呈橢圓形，染淡藍(lán)色，胞質(zhì)染淡紅色，細(xì)胞生長于網(wǎng)架纖維之間，外形飽滿，具有良好的生長形態(tài)，在細(xì)胞與纖維之間以及細(xì)胞與細(xì)胞之間均有較多突起相互交連（圖4）。

圖1 傳代培養(yǎng)2 d后細(xì)胞生長狀況

圖2 臍帶MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后堿性磷酸酶活性高（左）；經(jīng)脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴（右）

圖3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與支架共培養(yǎng)2周后細(xì)胞生長狀況

圖4 支架與細(xì)胞共培養(yǎng)蘇木精-伊紅染色（左：培養(yǎng)2周時間；右：培養(yǎng)3周時間）

3 討論

MSCs是骨組織工程的理想種子細(xì)胞，骨髓是目前MSCs的主要來源[3]。然而由于其細(xì)胞數(shù)量和增殖分化能力隨年齡增長而顯著下降，移植物不便在體外預(yù)先定制，異體移植中的倫理爭議以及病毒傳染等問題又限制了其臨床應(yīng)用[4]。在前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)條件下可以分別向骨、軟骨、脂肪組織分化，在體內(nèi)具有成骨能力，可以為骨組織工程提供新的種子細(xì)胞來源。本研究從人類臍帶中分離、培養(yǎng)MSCs，其細(xì)胞免疫表型與骨髓源性的MSCs相似，只表達(dá)HLA-Ⅰ類分子，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子，也不表達(dá)共刺激分子。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，未分化的MSCs可以抑制同類基因的增殖反應(yīng)。有人將人類臍帶基質(zhì)分離的MSCs直接注入Hemi Parkinson模型鼠的腦內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，并且部分緩解了該模型的典型癥狀，這表明UC-MSC有免疫逃避能力，如果MSCs能夠避免同種異體移植障礙，其臨床應(yīng)用前景廣闊[3]。

單純細(xì)胞移植由于缺乏附著點(diǎn)和空間結(jié)構(gòu)支持而呈漂浮狀態(tài)，無良好的移植微環(huán)境將不利于細(xì)胞存活和發(fā)揮正常功能。因此在損傷部位橋接組織工程支架材料受到了廣泛關(guān)注，可作為移植治療的載體及移植后的生長支架，對病灶起支撐填充作用，待細(xì)胞分化增殖填充后又可自行降解。采用組織工程方法構(gòu)建器官來修復(fù)或替代損傷組織、器官是具有廣闊前景的新途徑[2]。

理想的載體材料應(yīng)該具有良好的組織相容性、生物降解性、生物工程活性等[1]。生物材料的生物相容性包括生物安全性和生物功能性。對生物材料相容性研究有很多方法，其中常用的有體內(nèi)直接植入法和體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)法兩種。體內(nèi)直接植入法由于受多種體內(nèi)環(huán)境因素的影響，較難準(zhǔn)確反映生物材料與組織細(xì)胞的相容性。而體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)可以直接觀察細(xì)胞與生物材料復(fù)合生長的情況，較前者更為敏感、客觀[4]，是近年來研究生物材料相容性的主要方法。因此，本實(shí)驗(yàn)選用膠原蛋白-硫酸肝素支架與MSCs在體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種生物材料對細(xì)胞的生長無明顯不良影響。通過形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)MSCs可以在膠原蛋白支架中逐漸貼附，還能進(jìn)一步增殖、分化。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞長入孔隙內(nèi)，說明支架有很好的細(xì)胞親和性，支架孔徑適合細(xì)胞粘附生長，可見膠原蛋白支架與MSCs具有很好的生物相容性。

膠原蛋白海綿是以牛跟腱為原材料，通過酶解，純化抽取高純Ⅱ型膠原，再根據(jù)連貫網(wǎng)絡(luò)技術(shù)制成，純度高，生物相容性優(yōu)異。膠原海綿呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能提供組織生長支架[5]，且其保持了蛋白質(zhì)的三維螺旋結(jié)構(gòu)，因而具有生物活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，膠原蛋白生物材料與干細(xì)胞具有良好的生物相容性，膠原蛋白支架有望作為組織工程載體材料應(yīng)用于臨床。

1汪洋,王友.間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4:231-233.

2王恒湘,邊素艷,陳金龍,等.間充質(zhì)干細(xì)胞不抑制體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖[J].組織工程與重建外科雜志,2006,2:248-250.

3王恒湘,郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生應(yīng)用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4:241-245.

4Lavik E,Langer R.Tissue engineering:current state and perspectives [J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,65:1-8.

5武繼民,李榮,王巖.膠原海綿作為止血和創(chuàng)面下敷料的臨床試驗(yàn)[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床雜志,2003,7:152-154. (收稿日期：2008年12月21日；修回日期：2009年1月14日)

Isolation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Umbilical Cord and Their Compatibility with Collagen Scaffolds

WANG Qi,DIAO Yinze,MA Qingjun.
Department of Orthopedics,Third Hospital of Beijing University,Beijing 100036，China.Corresponding author:MA Qingjun.

ObjectiveTo search optional biomaterials for mesenchymal stem cells(MSCs)based tissue construction.The compatibility of human umbilical MSCs with collagen scaffolds was investigated in vitro.MethodsHuman umbilical MSCs were isolated by direct explant culture,and the phenotypic and differentiation characteristics were analyzed by flow cytometric technique and histological staining respectively.MSCs were seeded onto the collagen scaffolds and the morphological,adhensive and proliferation features were observed.ResultsThe cells were homogenous phenotype and occupied the ability of osteogenesis and adipogenesis in vitro.The cells were adhered and spread into the scaffolds thoroughly.The cells covered around 80%of the total volume of the scaffold after two weeks.ConclusionHuman umbilical MSCs could be readily isolated and harvested by explant-culture method.Collagen scaffold may be served as an optional biomaterial for three-dimension culture of MSCs.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Collagen;Scaffold;Compatibility

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－01－0001－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.001

國家自然科學(xué)基金（30571870）。

100036北京市北京大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科。

馬慶軍。