淫羊藿苷通過下調ATF6-DR5信號通路改善異丙腎上腺素所致小鼠左心室心肌細胞凋亡

曾凡群，李曉彤，林小英，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫科大學藥學院，基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

心力衰竭的死亡率居高不下，嚴重影響患者的生活質量，左心室重構是心力衰竭發生發展的重要病理基礎，主要表現為心肌細胞凋亡、心肌細胞肥大和心肌纖維化[1-2]。其中，心肌細胞凋亡是左心室重構的重要機制之一，參與眾多心血管疾病的病理過程[3]。此外，細胞凋亡引起心肌細胞的喪失與心力衰竭的發生發展密切相關。因此，減輕心肌細胞凋亡是改善左心室重構、預防心力衰竭的重要策略。

心肌細胞凋亡的機制十分復雜。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是心肌細胞凋亡的重要途徑之一[4]。葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)為ERS的標志性蛋白。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)是誘導心肌細胞凋亡經典模型的工具藥之一，用于心臟疾病的研究[5]。研究表明[6]，ISO誘導的心肌細胞凋亡模型中，GRP78與活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)的蛋白水平明顯升高、心肌細胞凋亡增多，導致心力衰竭。當細胞受到刺激誘發ERS時，ATF6與GRP78解離后激活死亡受體5(death receptor 5，DR5)表達，促進細胞凋亡[7]。因此，抑制ATF6-DR5信號通路是減輕心肌細胞凋亡的途徑之一[7-8]。

淫羊藿苷(icariin, ICA)系小檗科淫羊藿屬(Epimediuml.)植物的主要活性成分之一，具有調節免疫系統、抗氧化、改善高血壓心臟病等藥理作用[9]。但ICA對ISO誘導的心肌細胞凋亡的研究尚未見報道。因此，本研究采用ISO誘導的心肌細胞凋亡模型，觀察ICA是否能夠改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡，并初步探討其機制是否與下調ATF6-DR5信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1藥品 ICA(純度≥98 %，批號:FY17420615，購于江蘇省南京澤朗醫藥有限公司)；ISO(純度:>99.0%，貨號:HY-B0468，購于MCE公司)。

1.1.2試劑 NON-Fat Powdered Milk(BBI公司，Lot: F704BA0001)；Albumin Bovine V(Solarbio公司，貨號:A8020)；GRP78抗體(proteintech公司，貨號:11587-1-AP)；ATF6抗體(proteintech公司，貨號:24169-1-AP)；DR5抗體(英國Abcam公司，貨號:ab8416)；GAPDH抗體(proteintech公司，貨號:10494-1-AP)；Anti-Rabbit IgG(BBI公司，貨號:D110058-0025)；High-sig ECL Western blot Substrat(Tanon公司，貨號:180-501)；Trans-Blot Turbo 5×Transfer Buffer(美國BIO-RAD公司，貨號:#10026938)；PVDF膜(millipore公司，貨號:IPVH00010)。

1.2 儀器Supply Mini-Protean3電泳儀；Mini Trans-Blot轉移系統(美國BIO-RAD公司)；Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R離心機(德國Eppendorf公司)；ChemiDoc 成像系統(美國BIO-RAD公司)；全波長酶標儀(Thermo公司)；RM2245組織切片機(德國Leica Biosystems公司)。

1.3 實驗動物6～7周齡的C57小鼠40只,許可證號:SCXK(湘)2014-0011，♂，40只C57小鼠于SPF級動物房適應性喂養10 d，自由飲水和進食。將其隨機均分為4組(n=10):① 正常對照組(Control組)；② ISO組；③ ICA低高劑量組(ICA-L組, ICA-H組)；除Control組外其他3組小鼠經頸背部皮下注射ISO(5 mg·kg-1·d-1)建立心肌細胞凋亡模型[6]，連續14 d。同時，ICA-L、ICA-H組灌胃給予ICA混懸液(15,60 mg·kg-1·d-1)，ISO組給予等量雙蒸水，連續14 d。Control組頸背部皮下注射等體積生理鹽水(0.01mL·g·d-1)并灌胃等體積雙蒸水，連續14 d。

1.4 左心室質量指數的測定末次給藥后稱量C57小鼠體質量。迅速打開胸腔，取心臟組織，立即置于預冷的PBS溶液中灌洗后用濾紙吸干水分，然后分離左心室(含室間隔)稱左心室重量(mg)，計算左心室質量指數(左心室重量/小鼠體重)。

1.5 左心室心肌細胞凋亡的檢測隨機切取心臟組織并置于4%中性甲醛溶液中固定，包埋，制作石蠟切片，3% H2O2消除內源性過氧化物酶，蛋白激酶K(20 mg·L-1)作用10 min破膜，TUNEL混合液37 ℃孵育1.5 h，converter-POD 37 ℃孵育35 min，以二氨基聯苯胺(DAB)顯色1～1.5 min、蘇木精復染30 s，流水沖洗10 min，用中性樹膠封片。使用Olympus顯微鏡觀察心肌細胞的凋亡情況并拍照記錄。凋亡心肌細胞核被染成棕色，正常核染成藍色。使用ImageJ軟件計數凋亡細胞數和總細胞數。細胞凋亡率為凋亡細胞數相對于細胞總數的比例。

1.6 左心室GRP78、ATF6和DR5蛋白水平的檢測于-80 ℃冰箱迅速取出冰凍心臟組織約50 mg，剪碎后放入500 μL RIPA 裂解液中，加入0.5 μL PMSF溶液，于冰上充分研磨后靜置30 min，4 ℃離心20 min(轉速:12 000 r·min-1)，用BCA法測上清液的總蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠行電泳過程，然后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot轉移系統轉膜，7% Non-Fat Powdered Milk 4 ℃封閉3～4 h，一抗結合: GRP78(1 ∶5 000)、ATF6(1 ∶1 500)、DR5(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃過夜孵育；Anti-rabbit IgG結合(1 ∶5 000)2～3 h，High-sig ECL Western Blot Substrat顯色，ChemiDoc成像系統獲取圖像并采用Image Lab軟件進行分析。

1.7 統計學分析按完全隨機對照要求收集整理并統計實驗數據，數據以±s表示，采用SPSS 18.0軟件進行One-way ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。

2 結果

2.1 左心室質量指數的改變與Control組相比，ISO組左心室質量指數明顯升高(P<0.05)。與ISO組相比，給予ICA后左心室質量指數逐漸降低，以ICA-H組差異最為明顯(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of ICA on left ventricular mass

2.2 左心室心肌細胞凋亡的變化TUNEL染色結果發現，與Control組相比，ISO組左心室心肌細胞凋亡率是8.94倍(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室心肌細胞凋亡率降低了31.1%(P<0.05)，見Fig 2。提示ICA能減輕ISO誘導的左心室心肌細胞凋亡。

2.3 左心室GRP78蛋白水平的變化Western blot結果發現，與Control組相比，ISO組左心室GRP78蛋白水平增加了42.7%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室GRP78蛋白水平減少了28.7%(P<0.05)，見Fig 3；提示ISO誘導的小鼠左心室心肌細胞凋亡存在ERS，而ICA能抑制ERS的發生。

Fig 2 Effect of ICA on cardiomyocytes apoptosis of left ventricular in C57 mice n=5)

Fig 3 Effect of ICA on GRP78 protein level in left

2.4 左心室ATF6蛋白水平的變化Western blot結果發現，與Control組相比，ISO組左心室ATF6的蛋白水平增加了22.2%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室ATF6的蛋白水平減少了22.5%(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of ICA on ATF6 protein level in left ventricle of C57 mice n=5)

2.5 左心室DR5蛋白水平的變化Western blot結果發現，與Control組相比，ISO組左心室DR5的蛋白水平增加了17.4%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室DR5的蛋白水平減少了24.4%(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 5 Effect of ICA on DR5 protein level in left ventricle of C57 n=5)

3 討論

心肌細胞凋亡的分子機制十分復雜。過度的心肌細胞凋亡促使高血壓心臟病患者從代償性左心肥厚轉為失代償性左心肥厚，導致左心室重構，繼而誘發心力衰竭[10]。ISO誘導的心肌細胞凋亡模型是目前公認的制備心肌凋亡模型之一[5]。該模型具有操作簡單、周期短等優點。ISO連續刺激后C57小鼠出現明顯的心肌細胞凋亡、ERS及炎癥浸潤[6]。在本研究中，ISO連續刺激14 d后，與Control組相比，ISO組左心室質量指數明顯升高。表明ISO導致C57小鼠左心室重構。給予ICA干預后，與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室質量指數明顯降低。提示ICA可減輕ISO誘導的左心室重構。Yang等[6]研究表明，ISO誘導C57小鼠左心室心肌細胞凋亡明顯增加。本研究TUNEL染色結果顯示，與Control組相比，ISO組左心室心肌細胞凋亡率明顯增加。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室心肌細胞凋亡率明顯減少；表明ICA具有改善ISO所致左心室心肌細胞凋亡作用。

GRP78屬于熱休克蛋白質70家族的成員，是內質網分子伴侶蛋白中最具代表性的蛋白之一，主要作用是促進蛋白質正確折疊、組裝和轉運。非ERS時，GRP78與跨膜傳感器結合處于失活狀態。ERS發生早期GRP78與跨膜傳感器分離，激活未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction, UPR)恢復細胞功能，防止ERS引起的細胞損傷，若ERS持續存在，高表達的GRP78觸發細胞凋亡相關信號通路，導致細胞損傷加重甚至細胞凋亡[12]。課題組前期研究表明[11]，淫羊藿次苷Ⅱ通過下調GRP78的表達減輕ERS，改善自發性高血壓大鼠左心室功能。本研究Western blot結果顯示，ISO組左心室GRP78的蛋白水平明顯升高，表明ISO激活ERS參與左心室心肌細胞凋亡的發生發展。ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室GRP78的蛋白水平明顯降低。提示ICA通過抑制ERS可有效改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

ATF6是內質網的跨膜傳感器之一，與GRP78解離后處于活化狀態。研究表明，ATF6通路激活誘導心肌細胞凋亡，導致肥胖的自發性高血壓大鼠發生心臟重構[13]。本研究Western blot結果顯示，與Control組相比，ISO組左心室ATF6的蛋白水平明顯升高。表明內質網下游凋亡蛋白ATF6被激活。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室ATF6的蛋白水平明顯降低。提示ICA通過抑制左心室ATF6的表達減緩ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

DR5是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，因其胞質區含死亡結構域，通過激活死亡受體募集Fas相關死亡結構域的接頭器來誘導細胞凋亡[14]。與GRP78解離后的ATF6可直接入核促使CCAAT/增強子結合同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)的表達，過表達的CHOP通過激活DR5受體導致心肌細胞凋亡[15-16]。本研究Western blot結果顯示，與Control組相比，ISO組左心室DR5的蛋白水平明顯升高，說明在ISO所致的左心室心肌細胞凋亡模型中DR5蛋白被激活。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室DR5的蛋白水平明顯降低。提示ICA可能通過降低DR5的蛋白水平改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

綜上所述，ICA具有改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡作用，其機制可能與抑制ATF6-DR5信號通路有關。

(致謝:本實驗在遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室完成，感謝黃波等老師提供的幫助！)