基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫(kù)構(gòu)建上的應(yīng)用

李素一

摘要基因捕獲是一種新的基因標(biāo)簽技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于植物突變體庫(kù)的構(gòu)建及基因分離。近年來(lái)，基因捕獲技術(shù)應(yīng)用于水稻突變體庫(kù)構(gòu)建方面取得了顯著進(jìn)展；介紹了基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫(kù)構(gòu)建上的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞基因捕獲；報(bào)告基因；水稻突變體庫(kù)

中圖分類號(hào) Q343.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2009）02-0125-02

水稻是世界上最重要的三大經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)也是生命科學(xué)研究的模式植物，水稻基因組的全序列得到破譯之后，分離和研究水稻中的基因功能成為一項(xiàng)迫切而重要的任務(wù)。基因捕獲是一種將帶有報(bào)告基因的重組載體隨機(jī)整合到基因組中，使插入基因被激活或失活，然后通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)和利用一些基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)分離被插入基因的研究基因功能的新方法。目前，它已被廣泛應(yīng)用于植物突變體庫(kù)的構(gòu)建和基因分離。近年來(lái)，基因捕獲技術(shù)應(yīng)用于水稻突變體庫(kù)構(gòu)建方面取得了顯著進(jìn)展，本文介紹了基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫(kù)構(gòu)建中的應(yīng)用。

1基因捕獲系統(tǒng)的類型

基因捕獲包括3種系統(tǒng)類型：增強(qiáng)子捕獲（enhancer trap）、啟動(dòng)子捕獲（promoter trap）和基因捕獲（gene trap），而基因捕獲實(shí)際上是這3種類型的統(tǒng)稱[1]。

1.1增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)

增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)是將報(bào)告基因與一個(gè)最小的啟動(dòng)子相連，組成一個(gè)增強(qiáng)子捕獲重組體（見圖1B）。典型的最小啟動(dòng)子含有TATA box及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它不能單獨(dú)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，只有當(dāng)它被插入位點(diǎn)附近的增強(qiáng)子激活時(shí)，才可起始轉(zhuǎn)錄而使報(bào)告基因表達(dá)。由此可推知插入位點(diǎn)附近有增強(qiáng)子或基因，即實(shí)現(xiàn)了以該增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)來(lái)發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子的目的。

1.2啟動(dòng)子捕獲系統(tǒng)

啟動(dòng)子捕獲系統(tǒng)中，利用一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因，隨機(jī)插入在基因組中，當(dāng)報(bào)告基因插入到內(nèi)源基因的外顯子中，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)方向和該基因的閱讀框一致時(shí)就會(huì)表達(dá)（見圖1C）。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因是否表達(dá)則可知該報(bào)告基因附近是否有啟動(dòng)子，檢測(cè)報(bào)告基因在生物體的什么部位表達(dá)即可知被插入基因的表達(dá)是否有特異性，從而起到了以之為誘餌，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的目的。

1.3基因捕獲系統(tǒng)

狹義的基因捕獲載體是指插入到結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部從而捕獲該基因的載體，帶有一個(gè)不含啟動(dòng)子的報(bào)告基因，包括內(nèi)含子捕獲載體和外顯子捕獲載體（見圖1D）。前者通常由報(bào)告基因和1個(gè)或者幾個(gè)剪接受體位點(diǎn)（splice acceptor，SA）組成，剪接受體位點(diǎn)在報(bào)告基因上游。該重組體如果插入到基因組的內(nèi)含子中，從染色體基因的剪接供體位點(diǎn)到報(bào)告基因的剪接受體位點(diǎn)的剪接就會(huì)使上游外顯子與報(bào)告基因融合，從而使報(bào)告基因隨著基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。后者插入在基因的外顯子，因此不需要添加SA位點(diǎn)就可以產(chǎn)生融合mRNA，所以如果能檢測(cè)到融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白，就可以證明插入位置附近有基因存在。

這3種捕獲系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，增強(qiáng)子捕獲不受插入位置的限制，且捕獲頻率往往較高，甚至可高達(dá)60%[2]。但由于增強(qiáng)子與基因的位置可近可遠(yuǎn)，故增強(qiáng)子捕獲不易定位基因。啟動(dòng)子捕獲系統(tǒng)捕獲的頻率比增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)低，但它產(chǎn)生的突變頻率較高。除轉(zhuǎn)錄融合外，啟動(dòng)子捕獲和增強(qiáng)子捕獲還能創(chuàng)造翻譯融合，從而為蛋白質(zhì)定位提供信息。

2基因捕獲系統(tǒng)中插入元件的類型

基因捕獲系統(tǒng)中，攜帶報(bào)告基因轉(zhuǎn)入到植物基因組中去的插入元件主要有2種：T-DNA和轉(zhuǎn)座子元件，二者各有優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1T-DNA

以T-DNA為介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化已成為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的常用方法。T-DNA標(biāo)簽法是以人工構(gòu)建好的T-DNA為標(biāo)簽，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將其導(dǎo)入植物基因組中，使插入位點(diǎn)的基因被激活或失活，通過(guò)TAIL-PCR或Inverse PCR獲得T-DNA的側(cè)翼序列，進(jìn)而捕獲該基因。由于T-DNA的插入通常是比較穩(wěn)定的，而且沒有位點(diǎn)特異性，所以利用T-DNA標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)就可以創(chuàng)建飽和的T-DNA插入突變體庫(kù)[3，4]。但它的一個(gè)不足之處在于T-DNA通常會(huì)在單一植株中造成多拷貝插入，可能是單個(gè)位點(diǎn)的多拷貝串聯(lián)，也可能是多個(gè)位點(diǎn)的T-DNA插入。這會(huì)導(dǎo)致對(duì)基因捕獲系統(tǒng)中報(bào)告基因表達(dá)模式的研究變得復(fù)雜。此外，插入事件中還往往有其他復(fù)雜的現(xiàn)象，比如T- DNA與臨近染色體DNA的重排或者本身的同向或反向串聯(lián)重復(fù)等[5]。這些情況都使被插入基因的分離和分析變得困難。

2.2轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子也常用來(lái)產(chǎn)生插入突變。常見的轉(zhuǎn)座子有玉米的Ac/Ds 和En/Spm轉(zhuǎn)座子，目前只有Ac/Ds系統(tǒng)可用于增強(qiáng)子捕獲和基因捕獲。Ac/Ds因?yàn)榭截悢?shù)低而得到廣泛的應(yīng)用，而En/Spm轉(zhuǎn)座子因它的高拷貝數(shù)會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因表達(dá)的復(fù)雜化，所以較少被利用。

Ac/Ds系統(tǒng)由自主轉(zhuǎn)座元件Ac和非自主轉(zhuǎn)座元件Ds組成。Ac編碼一個(gè)轉(zhuǎn)座酶，與Ac和Ds的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列相結(jié)合，催化其向基因組中的其他位置轉(zhuǎn)座。Ds失去轉(zhuǎn)座酶活性，不能編碼轉(zhuǎn)座酶，無(wú)法自主轉(zhuǎn)座，但它尚保留末端倒位重復(fù)序列，能被Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別，從而催化轉(zhuǎn)座的發(fā)生。利用這種雙元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以產(chǎn)生穩(wěn)定的插入，還可通過(guò)有性雜交在轉(zhuǎn)座植株中引入轉(zhuǎn)座酶誘導(dǎo)再次轉(zhuǎn)座，這時(shí)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座可以引起回復(fù)突變，以驗(yàn)證所分離基因的功能。

3基因捕獲系統(tǒng)中報(bào)告基因的類型

3.1β-葡萄糖苷酸酶基因

β-細(xì)菌的葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，gusA）是植物中常用的報(bào)告基因。用gus基因作為報(bào)告基因的主要優(yōu)點(diǎn)是其產(chǎn)物GUS蛋白相當(dāng)穩(wěn)定，而且與其他蛋白融合后仍能保持生物活性。而GUS蛋白的活性很容易通過(guò)組織化學(xué)染色方法被檢測(cè)到，這種檢測(cè)非常靈敏，甚至能檢測(cè)到gus在單細(xì)胞中的表達(dá)。但它的不足之處在于酶促反應(yīng)底物相當(dāng)昂貴，成本高。另外，組織化學(xué)染色會(huì)對(duì)活體組織造成破壞，因此GUS檢測(cè)無(wú)法用于活體組織。

3.2綠色熒光蛋白基因

水母的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因也被廣泛應(yīng)用于植物的基因捕獲中。因它的產(chǎn)物可發(fā)出熒光，因而只要有適當(dāng)?shù)墓庠醇纯杀粰z測(cè)到，相對(duì)經(jīng)濟(jì)廉價(jià)。此外GFP的檢測(cè)不具有破壞性，因而可進(jìn)行活體檢測(cè)。但GFP應(yīng)用于植物中也有其限制性，例如GFP的表達(dá)量與植物本身的生理特征很有關(guān)系，GFP熒光素會(huì)隨著葉片的成熟和葉綠素的增多而減少，另外，若是應(yīng)用在禾本科植物中，厚厚的角質(zhì)層會(huì)使熒光不容易透過(guò)[6]。

3.3其他可供選擇的基因

除了常用的gus基因和GFP基因，來(lái)自玉米R(shí)基因家族的Lc基因極有希望成為一個(gè)新的報(bào)告基因。Lc調(diào)控花青素的生物合成，它在其他植物中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致花青素的積累[7]。用它作報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)在于不需要昂貴的底物，且不具有破壞性。

4基因捕獲技術(shù)在水稻突變體庫(kù)構(gòu)建中的應(yīng)用

隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)的成熟和不斷完善，人們?cè)谒局幸呀⒘司哂幸欢ㄒ?guī)模的基因捕獲突變體庫(kù)[3]。Jeong等用激活標(biāo)簽法獲得了50 000個(gè)突變系，分離到27 621個(gè)插入位點(diǎn)序列，經(jīng)研究表明在預(yù)測(cè)的57 888個(gè)基因中共有15 166個(gè)發(fā)生插入突變[8]。Sallaud等利用3種T-DNA載體（p4978，p4984和 p4956ET15），在cv.Nipponbare中構(gòu)建了一個(gè)含有40 000個(gè)T-DNA插入株系的水稻插入突變體庫(kù)[9]。利用以gfp為報(bào)告基因的載體p4956ET15，法國(guó)的研究者們構(gòu)建了一個(gè)增強(qiáng)子捕獲突變體庫(kù)，并已利用該突變體庫(kù)進(jìn)行種子繁殖和表型評(píng)價(jià)的研究[10]。

2002年，我國(guó)建立了第1個(gè)水稻T-DNA插入突變體庫(kù)，該突變體庫(kù)總共獲得了12 000多個(gè)獨(dú)立的T-DNA插入株系，表型分析和分子檢測(cè)表明所獲得的植株95%為轉(zhuǎn)基因植株，單位點(diǎn)插入的株系約占2/3，并發(fā)現(xiàn)了一批與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的突變體，包括在株型、育性、生育期、分蘗、株高上有突變和抗病蟲、抗逆、葉色等類型的突變體。由張啟發(fā)院士主持的水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)功能基因組研究課題組也創(chuàng)建了一個(gè)大型的T-DNA插入突變體庫(kù)。至2005年時(shí)，該突變體庫(kù)含有27 000個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子，獲得了功能基本明確且具有明顯應(yīng)用前景的新基因107個(gè)，其中有18個(gè)涉及到產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、抗逆和營(yíng)養(yǎng)高效等重要農(nóng)藝性狀的基因，如抗白葉枯病基因Xa26和Xa13、包臺(tái)型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b、礦物質(zhì)吸收相關(guān)的檸檬酸合成酶基因CS及抗逆基因OsNAC等[11]。2006年，他們將利用增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)構(gòu)建的一個(gè)含有129 000個(gè)水稻突變株系的群體整理成RMD（Rice Mutant Database，http：//rmd.ncpgr.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)既能進(jìn)行突變基因與調(diào)節(jié)元件的分離鑒定，也可以進(jìn)行目標(biāo)基因在特定組合或特定發(fā)育時(shí)期的異常表達(dá)模式[12]。張治國(guó)等在粳稻品種日本晴中獲得了包括基因激活標(biāo)簽系和增強(qiáng)子標(biāo)簽系在內(nèi)的近100 000份T-DNA獨(dú)立插入標(biāo)簽系，其中有明顯突變表型的捕獲系共4 500余份，突變性狀包括株高、株型、穗型、粒型和大小、生育期、育性、葉色、葉型、分蘗力等。Enokil等利用Ac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建水稻插入突變體庫(kù)，該突變?nèi)后w有15%~50%的插入位點(diǎn)，在許多Ac的插入株系中，平均有4個(gè)Ac拷貝數(shù)[13]。Greco等利用增強(qiáng)子捕獲載體建立了Ac/Ds插入突變體庫(kù)，該群體的T0代植株62%表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)座活性，T1代植株92%有轉(zhuǎn)座活性，而70%的T2、T3植株Ds失去了轉(zhuǎn)座活性。對(duì)T1代植株插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Ds的插入傾向于基因密度較高的區(qū)域[14]。

5結(jié)語(yǔ)

2005年在Nature上公布的水稻遺傳圖譜表明，水稻基因組12條染色體上共有37 554個(gè)基因。利用基因捕獲所構(gòu)建的這些水稻突變體庫(kù)，無(wú)疑為分離和研究水稻中數(shù)目龐大的基因提供了一條有效的新途徑。突變?nèi)后w的構(gòu)建為功能基因組學(xué)的深入研究搭建了一個(gè)極好的平臺(tái)，相信不斷發(fā)展和完善的基因捕獲技術(shù)將會(huì)大大促進(jìn)人們對(duì)于植物功能基因組學(xué)的研究。

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（上接第126頁(yè)）

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注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。”