內質網應激和熱休克與運動

李煥春　肖國強

摘要：各種外界環境的刺激能引起內質網內穩態失衡，發生內質網應激；內質網應激是細胞的一種自我保護性措施，以維持細胞穩態功能。受熱刺激后，機體產生相應的熱休克反應，誘導細胞合成應激的熱休克蛋白，并提高細胞的抗損傷能力；運動也能刺激內質網發生應激反應，產生熱休克蛋白，發揮對機體的保護作用。

關鍵詞：運動生理學；內質網應激；熱休克；身體運動；綜述

中圖分類號：G804.2文獻標識碼：A文章編號：1006-7116(2009)01-0109-04

Endoplasmic reticulum stress, heat shock and exercising

LI Huan-chun，XIAO Guo-qiang

（School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

Abstract: Stimulation from various external environments can cause the unbalance of homeostasis in endoplasmic reticulum, which results in endoplasmic reticulum stress; endoplasmic reticulum stress is a self protection measure taken by cells in order to maintain homeostatic functions of cells. Subjected to heat stimulation, the body produces corresponding heat shock reaction, which induces cells to synthesize heat shock protein for stress, and to enhance the damage resisting ability of cells; exercising can also stimulate endoplasmic reticulum to produce stress reaction and heat shock protein, thus playing a role in body protection.

Key words: exercise physiology；endoplasmic reticulum stress；heat shock；physical exercising；overview

內質網(endoplasmic reticulum，ER)為分布于哺乳細胞細胞質中一種重要的亞細胞器，為內膜構成的封閉的網狀管道系統，具有復雜的膜結構，由于內質網為細胞中一個動態的膜性細胞器，因此具有多種功能。內質網在機體中的作用主要體現在蛋白質的合成、修飾、折疊和一些亞基的組合方面，另外對類固醇、脂質、糖原等大分子有機化合物的合成、細胞內鈣的儲存以及鈣離子濃度穩定等也有作用，因此內質網對保持細胞內穩態、維持細胞正常的生理功能具有重要作用。

1內質網應激

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指由于內質網中鈣離子紊亂和蛋白質不能正常折疊，導致細胞內質網內穩態失衡，從而使其生理功能發生紊亂的一種亞細胞器的病理過程，是線粒體應激和細胞核應激通路組成部分。細胞應對外界刺激而使內質網應激產生的反應，稱作內質網應激反應。從細胞的應激反應順序來看，內質網應激反應發生在線粒體應激和細胞核應激之前，是應激發生在細胞中的最初反應。研究表明，影響機體內蛋白質合成的因素或者某些毒性物質，以及內質網腔內鈣濃度的不平衡對內質網的干擾，都會影響內質網內穩態，從而產生內質網應激[1]；Wong WL[2]首次發現內質網鈣平衡破壞導致蛋白質翻譯停止，并且指出這種現象是細胞的一種自我保護性措施，以達到維持內質網穩態功能。研究表明，大強度或長時間運動的內質網應激反應可以引起細胞的凋亡[3]，從而引發疾病。另外運動后缺血性再灌注所造成機體損傷，糖尿病、阿茲海默癥、帕金森病和癌癥等相關疾病與內質網應激也密切相關。

2內質網應激通路

動態的膜性內質網是真核細胞中重要的細胞器，在細胞內鈣調節，生物大分子合成、修飾等方面發揮重要作用，雖然內質網具有較強的維持機能的能力，但仍有許多原因能引發內質網功能失調，例如細胞氧濃度的低下和營養物質不足、肽鏈的折疊受阻、細胞病毒的侵入、內質網內外鈣濃度動態的失調等都可能引發內質網應激，產生應激反應。真核細胞內質網應激產生的反應是細胞一種保護性機制的體現[4]，在細胞內至少有以下幾種通路，以適應內質網應激反應。

1)未折疊蛋白應激通路。

哺乳動物細胞中存有抑制物阻抗性酯酶1(inositol requirement 1，IRE-1)、活化轉錄因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)和雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內質網激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)3種蛋白與內質網應激密切相關，在內質網不發生應激時，這3種物質以無活性形式與葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein，GRP78)或免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin-binding protein，Bip)結合[5]，GRP78是內質網分子伴侶蛋白，相對分子質量為78，在進化上高度保守，在維持內質網蛋白質合成，及正確折疊和細胞鈣穩態方面起著重要的作用，而細胞內鈣失穩態、自由基超負荷、蛋白質糖基化障礙、內質網腔內錯誤折疊蛋白的聚集，均可引發內質網應激，使GRP78蛋白表達上調，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。未折疊蛋白應激通路表現在蛋白質的不正確折疊引發的內質網應激，在發生未折疊蛋白反應時，未折疊蛋白在細胞內積聚過多，誘發上述3種感應蛋白與GRP78或Bip分離，激發感應蛋白的活性[6]，上述過程中PERK自身聚合、自我磷酸化激活，使得eIF2a(subunit of eukaryotic translation initiation factor 2)上的Ser 51磷酸化，因而不能結合G蛋白，而阻斷起始蛋氨酸-RNA與核糖體的結合，使蛋白質翻譯無法開始，從而使蛋白質合成下調，這種未折疊反應，有利于阻止新生蛋白向內質網腔的轉運，抑制內質網蛋白的過負荷狀態，發揮對細胞的保護作用。

2)伴侶蛋白基因活化通路。

熱休克蛋白家族中的GRP78或Bip是內質網應激反應標志性伴侶蛋白，是HSP70的成員之一，在參與內質網蛋白質的重新折疊和裝配過程中發揮作用，因此對保護細胞避免因內質網應激引發細胞凋亡非常重要。內質網應激時誘導基因表達存有與IRE-1、ATF-6和ATF-4相關聯的不同通路，在發生內質網應激時參與編碼內質網蛋白的基因折疊、轉運、分泌、降解的基因，可被活化的上述物質誘導表達。IRE-1主要是對轉錄活化含有上游ERSE (ER stress response clement or the unfolded protein response element(UPRE))的基因；在應激發生后ATF-6會從內質網膜轉移到高爾基體，水解后與ERSE發生作用，從而激活GRP78或Bip、CHOP(C/EBP homologous protein)或GADDI53(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153)、ERp72(ER protein 72)等多種應激反應蛋白的轉錄。CHOP主要參與調節下游相關基因的表達，是內質網應激的標志；同樣，發生應激時ATF-4蛋白合成得以增加，聚集在核內的表達產物促使GRP78或Bip、CHOP或GADDI53等蛋白的生成[7]。

3)細胞凋亡通路。

內質網應激不僅是細胞抵抗應激的重要機制，而且也是應激細胞發生損傷的重要原因。適度的內質網應激能刺激應激蛋白基因表達增加，產生細胞保護機制，提高細胞生理狀態而達到保護作用；相反，當機體受到刺激的應激強度超過細胞自身處理能力時，細胞會通過啟動各種信號機制引發細胞程序性凋亡。細胞凋亡的過程比較復雜，具有多樣性，其途徑與細胞所處的環境、種類或刺激形式有關。細胞在發生內質網應激時，產生應激蛋白以抵消刺激造成的不利影響，同時內質網功能進行適應性的改變，以滿足環境的變化；另一方面細胞也會產生應激蛋白調節基因，引發應激細胞程序死亡，以清除不能適應環境變化的細胞。

過度或長時間內質網應激會損傷內質網功能，促使細胞發生凋亡，內質網應激引起的細胞凋亡與因線粒體誘發的細胞凋亡機制不一樣，稱為內質網相關性死亡(ER-associated death)ERAD途徑。ERAD途徑包含內質網應激誘導CHOP或GADD153表達、JNK(cJun NH2-terminal kinase)活化和內質網特有的半胱氨酸蛋白酶caspasc-12的激活3種方式。CHOP和JNK都在內質網應激與細胞凋亡起著重要的中間信號作用。CHOP主要參與調節下游凋亡相關基因的表達，是內質網應激的標志。正常生理狀態下CHOP濃度非常低，當發生內質網應激時，其濃度顯著增加，表明其被誘導表達。當發生應激時，上游的IRE1、PERK和ATF會介導CHOP或GADD153基因的轉錄激話。研究證實CHOP高表達，能影響內質網蛋白的折疊功能，從而引發細胞周期停滯和DNA損傷，使細胞發生凋亡；JNK是信號轉導蛋白家族一分子，主要調節基因表達和決定應激狀態下細胞的存活或凋亡；caspasc-12是內質網膜上的結構蛋白，內質網應激時，在鈣蛋白酶、GRP78或caspas-7復合物及IRE 1-TRAF2復合物等作用下，發生特定位點裂解后活化，并激活下游的caspasc-9和caspasc-3，從而導致細胞凋亡[8]。

3內質網應激、熱休克與運動的相關性

內質網在受到長時間或大強度運動刺激時，發生內質網應激反應產生應激蛋白，對細胞發揮保護作用。應激蛋白是調節正常機體細胞分化、增殖的一種蛋白質，在胚胎時期的表達水平比較高，但在機體出生后，其表達水平則大大降低。人體在受熱應激后可發生熱應激反應，并在機體內產生相應的熱休克反應，誘導細胞合成應激蛋白(stress protein，SP)、熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)。熱休克蛋白是一種應激蛋白，可提高細胞的抗損傷能力[9]，現已證實HSP普遍存在于從細菌到人的整個生物界，目前已發現的HSP已有10多種，根據相對分子質量大小和同源程度，可分為HSP110、HSP90、HSP70及HSP60、小分子HSP及泛素等幾個家族。HSP70是HSP中最豐富的一種，根據其表達情況的不同可分為結構型和誘導型，前者存在于非應激的正常細胞中，在正常情況下即表達，應激后略增加；后者僅出現于應激細胞中[10]。這些蛋白存在于細胞內的不同區域，熱休克時，大部分誘導型HSP70位于細胞核內，細胞恢復時則移入胞漿，再次熱休克時又重新轉回細胞核內。結構型HSP70又可分為兩種，分別位于內質網和線粒體內。HSP70分別在其各自所在的區域內發揮作用，其中HSP70及其部分相關基因，在人類定位于6對、14對、21對等染色體上，其數量在不同生物身上有所不同，功能上也存在差異，并且由于HSP70在正常細胞中水平較低，而在應激狀態下可顯著地升高，因此成為熱休克蛋白中最受關注、研究最深入的一種[11-13]，HSP70中的GRP78或Bip就是內質網應激反應標志性伴侶蛋白，而HSP90家族中的Gp96是相對分子質量為96 000的糖蛋白，幾乎高度表達于所有細胞的內質網中，與其他的HSP一樣，Gp96可被環境壓力及累積的錯誤折疊蛋白所誘導，而發生分子伴侶作用。HSP作為細胞中的伴侶蛋白發生作用，伴侶蛋白是細胞內一類能介導其它蛋白正確裝配，本身卻不具功能的最終裝配產物的組成成分，其作用是與新生、未折疊、錯折疊或聚集的蛋白質相結合，使某些蛋白質聚集物解離，加速正確的膚鏈折疊和重折疊，維持某些肽鏈的伸展狀態以利于其跨膜轉位，在線粒體、內質網等不同的區域內發揮作用，同時還促進某些變性蛋白的降解和清除，重新激活某些酶的作用，以維護細胞的功能和生存[14-15]。HSP作為分子伴侶，其機制可能為HSP以依賴于ATP的方式結合和釋放非天然構象多肽的疏水片段，并通過遮蔽這些片段而穩定蛋白質的松馳構象和阻止聚集。熱應激刺激誘導細胞產生HSP，不僅使細胞對該刺激的耐受性增加，也增加了細胞對其它應激原刺激的耐受性。研究表明HSP70或其含有羧基端部分的碎片，具有保護細胞免受熱應激損害的作用，包含氨基端部分的蛋白碎片則無此效應。而且只有HSP70的完整表達，才能降低熱應激時的翻譯抑制程度，才能最有效地加速轉錄和翻譯抑制的恢復。

運動是誘導內質網發生應激的刺激形式，研究證明，運動能引起局部組織器官缺血，使肌肉溫度升至45℃[16-17]。高強度或長時間負荷運動對內質網應激作用比較明顯，有報道1 h力竭跑后，肌肉中的HSP32 mRNA增加7倍，并且運動后的一段時間HSP70 mRNA表達呈增加趨勢[18]；HSP在機體內的生成與肌肉組織種類相關，并且與肌肉募集方式、肌肉負荷以及運動強度有關。有研究報道，長時間亞極量運動后，大鼠下肢比目魚肌、腓腸肌和左心室肌HPS70濃度升高，但肌肉中的HSP70濃度卻不一樣，這可能與不同肌肉組織中運動時能量的消耗程度不同有關[19-20]；Liu Y[21]發現4周的遞增負荷運動中，后一個負荷后股四頭肌細胞中HSP72含量比前一個負荷要高。高強度的訓練能誘導肌肉產生熱休克蛋白，而低強度的耐力訓練不足以誘導其表達；同樣，中等強度訓練不足以刺激血液白細胞HSP70的表達，預示著HSP的產生與能量在肌肉中消耗的程度相關，ATP的減少可能是誘導HSP生成的重要原因。因此大強度或長時間運動引起骨骼肌HSP的表達增加，其原因可能是運動時肌肉不同形式的收縮及機體新陳代謝的加快，使細胞所處的內環境發生了改變，刺激細胞內質網功能，產生內質網應激反應，加速細胞應激反應信號傳導啟動，從而合成一系列內質網應激相關蛋白，激活機體的免疫機制，增強機體對外界損傷的抗御能力[22-23]，發揮對機體的保護表達作用。在缺少熱刺激的情況下，運動引起的肌肉收縮、血流改變及新陳代謝的加快、ATP的減少等應激都可能是誘導HSP70合成的刺激因素，雖然運動可能通過一個獨特的通路引起熱休克蛋白的合成，但很可能運動與其他代謝應激之間有共同的機制。

內質網應激是細胞自我保護性機制的表現，是一種涉及多信號通路和多基因調控復雜的生理過程，內質網應激可以激活內質網分子伴侶HSP，來發揮細胞對應激的抵抗能力，維持細胞的生存。一定強度或時間的運動可能使內質網發生應激，抵抗運動對機體帶來的運動損傷，但強度過高的運動可能使內質網過度應激，而發生細胞凋亡。因此探討運動后內質網應激與熱休克反應的關系，對評價和監控運動訓練具有十分重要的意義。

參考文獻：

[1] Kaufman R d. Orchestrating; the unfolded protein response in health and disease[J]. J Clin Invest，2002，110：1389-1398.

[2] Wong W L，Brostrom M A，Kuznetsov G，et al. Inhibition of protein in synthesis and early protein in processing by thapsigargin in cultured cells[J]. Biochem J，1993，289：71-79.

[3] Hossain G S，van Thienen J V，Werstuck G H，et al. TDAG51 is induced by homocysteine，promotes detachment-mediated programmed cell death，and contributes to the development of atherosclerosisin hyperthermia ocysteinemia[J]. J Biol Chem，2003，278：30317-30320.

[4] Araki E，Oyadomari S，Mori M. Impact of endoplasm is reticulum stress pathway on pancreatic[J]. Cells and Diabetes Mellitus Experimental Biology and Medicine，2003，228：1213-1217.

[5] Komitzer D，Ciechanover A. Modes of regulation of ubiquitin mediated protein degradation[J]. J Cell Physio J，2000，182(1)：1-11.

[6] Yamamoto I，Hamada H，Shinkai H，et al. The KDEL receptor modulates the endoplasmic reticulum stress response through mitogen-activated protein kinas signal-ing cascades[J]. J Biol Chem，2003，278(36)：34525-34532.

[7] Shibata M，Hattori H，SasakiＴ，et al. Activation of caspase-12 by endoplasmic reticulum stress induced by transient middle cerebralartery occlusion mice[J]. Neuroscience，2003，118：491-499.

[8] 馮獻啟，鄒萍. 內質網應激反應性凋亡途徑究進展[J]. 國外醫學：腫瘤學分冊，2004，31：726-729.

[9] Donncllv T T，Sicvers R E，Viassen F L，et al. Heat shockproteininduction in rat hearts: a role for improve myocardialsa salvage after erischemia and reperfusion[J]. Circulotion，1992，85：769-778.

[10] Welch W J. Mammalian stress response：Cell physiology structure function of stress proteins，and implications for medicine and disease[J]. Physiol Rev，1992，72：1063-1081.

[11] Tekin D，Xi L，Zhao T，et al. Mitogen 2 activated protein kinases mediate heat shock 2 induced delayed protection in mouse heart[J]. Am Physiol Heart CircPhysiol，2001，281(2)：523-532.

[12] Park J，LiuA Y. NK phosphorylated the HSF1 transcriptional actvation domain:role of JNK in the regulation of the heat shock response[J]. Cell Biochem，2001，82(2)：326-328.

[13] Tokuda H，Kozawa O，Niwa M，et al. Mechanism of prostaglandE2-stimulated heat shock protein induction in osteoblast like MC3T3-E1cells[J]. Endocrinol，2002，172(2)：271-281.

[14] Ellis K J. The molecular chaperone concept[J]. Semis Cell Biol，1990(1)：1-9.

[15] Pelham H R B，Morimoto R I. Functions of the HSP70 protein family: An overview：Stress proteins in biology and medicine[M]. Cold Spring Harbor NY：CPHf Press，1990：287-299.

[16] Brook U A. Elittelman I C，Faulkner J A，et al. Temperature skeletal muscle mitochondrial functions, and oxygen debt r1m[J]. J Physiol，1971，31：416-422.

[17] Fsrooks G A，Hittelman K J， Faulkner J A，et al. Tissue temperatures and whole animal oxygen consumption after exercise[J]. Ant J Physiol，1971，221：427-431.

[18] Essig D A，Borger D R，Jackson D A. Induction of heme oxygenas-1(HSP32) mRNA in skeletal muscle following contractions[J]. Am J Physiol，1997，272：59-67.

[19] Skidntore R，Gutierrez J A，Guerriero V，et al. HSP70 induction during exercise and heat stress in rats：role of internal temperature[J]. J Physiol，1995，268：92-97.

[20] Iwaki K，Chi S H，Dillman W H，et al. Induction of HSP70 in cultured rat neonatal cardiomyocytes by hypoxia and metabolism stress[J]. Circulation，1993，87(6)：2023-2032.

[21] Liu Y，Mayr S，Opitz-GressA，et al. Human skeletal muscle HSP70 Response to training in highly trained rowers[J]. J Appl Physiol，1999，86：101-104.

[22] 錢令嘉，吳孟平，陳西京，等. 熱應激大鼠心肌鈣代謝的變化及其機理探討[J]. 中國應用生理學雜志，1997，13(1)：30-35.

[23] Buss R，Fleming I. Regulation and functional consequence of Endothelial nitric oxide formation [J]. Ann Med，1995，27：331-334.