胚挽救技術應用于無核葡萄育種的研究進展

范春霞 周 燕 高述民 張小方

摘要植物的胚挽救技術在無核葡萄的育種研究中發展迅速,通過對胚挽救技術及其在無核葡萄育種上的應用以及影響胚挽救的因素進行綜述,指出了葡萄胚挽救技術存在的不足,并對其今后研究方向提出展望。

關鍵詞 胚挽救技術;無核葡萄育種;應用;研究進展

中圖分類號S663.1文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)09-0019-02

無核鮮食葡萄（Vitis vinifera L．）一直深受廣大消費者的喜愛。無核性狀作為葡萄重要的商品性狀是當前葡萄育種的重要目標之一。20世紀以有核品種為母本的有性雜交方式選育效益很低，隨著胚挽救技術的應用，極大地縮短了無核葡萄選育的育種周期，使無核葡萄的育種有了長足地發展。將胚挽救技術用于無核葡萄育種是十分有效的，并為解決無核葡萄育種中的問題開辟了新思路。

1無核葡萄的胚挽救技術

無核葡萄根據其授粉結實的特性可分為2類：一類稱單性結實型（Parthenocarpy），就是卵細胞不經過受精作用而直接發育成果實；另一類稱假單性結實型（Pseudo-Parthen-ocarpy），即種子敗育型（Stenospermocarpy），就是雖受精，但受精后的胚很快停止發育導致無核果實產生，這種類型的品種占無核品種的85%以上。

胚挽救技術就是通過選擇假單性結實類型的無核品種，在其合子胚敗育之前進行人工離體培養，減少幼胚的敗育，利用胚乳及培養基中的營養使其發育成充實的胚，最終形成完整的植株。之前，以有核材料（母本）×無核材料（父本）的雜交方式培育的無核葡萄品種的無核比率很低，且選育1個品種的周期非常長（10年以上）。現利用胚挽救方法可進行“無核×無核”方式雜交，通過胚挽救其后代來培育無核品種，并結合現代生物技術，從而使無核比率成倍提高，且大大縮短了品種的選育時間。

2胚挽救技術在無核葡萄育種上的應用

2.1培育無核葡萄品種

無核葡萄品種間雜交或以無核葡萄品種作母本進行雜交是培育無核葡萄品種的有效途徑，而胚挽救技術使這種雜交方式成為現實。從Ramming等首次報道利用胚挽救技術獲得無核葡萄實生苗以來，世界各國利用該方法相繼獲得了許多無核葡萄新資源，且選育出優良的無核葡萄品種。并通過深入研究基因型、培養基、取樣時期以及它們間的相互作用對無核葡萄胚珠培養的影響，建立了輔助無核葡萄育種的胚挽救技術程序[1]。我國自20世紀90年代后也相繼開展了此項研究，并打下了一定的實踐基礎。程和禾等[2]通過對接種時期、基本培養基和激素配比、低溫等因素的研究，建立了較為簡單實用的奧迪亞無核葡萄幼胚搶救體系，為奧迪亞無核葡萄作母本進行雜交育種奠定了技術基礎。唐冬梅、閆愛玲等通過大量試驗對胚挽救的多個影響因素進行了進一步地研究和驗證，更加完善了胚挽救技術在無核葡萄育種上的輔助應用程序[3，4]。

2.2克服雜交不親和

遠緣雜交是將野生種抗性基因組轉移至栽培品種，或將不同種的優良基因重組的一種有效育種方式。由于遠緣雜交雜種胚、胚乳和子房組織間缺乏協調性，致使雜種胚部分或全部壞死，有時受精后的幼胚不發育或中途停止發育，導致難以獲得雜種苗。胚挽救技術在克服遠緣雜交的不親和性方面發揮了巨大的作用[1]。Goldy和Ramming等首先通過胚挽救技術，分別獲得了多株胚挽救苗。我國首次利用無核葡萄×中國野生葡萄雜交結合胚挽救技術，獲得51株雜種后代。李金月等[5]用無核葡萄與抗性強的有核葡萄雜交獲得無核、抗性強、可利用的雜種后代，改變了無核葡萄抗性差的弊端?？梢姡咄炀燃夹g是克服遠緣雜交不育的一種有效方法。

2.3三倍體育種

三倍體育種是獲得優質大粒、抗病及抗逆性好的無核葡萄品種的重要途徑之一。獲得三倍體無核葡萄，最有希望的方法是二倍體與四倍體間的雜交。郭印山等對二倍體與四倍體葡萄雜種胚珠采取橫切的方法獲得了三倍體植株，并采用L25（55）的正交試驗證明了影響胚挽救成苗率最重要的是接種時間， 然后是各種植物激素的濃度[6]。而閆愛玲等[4]以二倍體葡萄為母本，與四倍體葡萄雜交，雜種進行胚珠培養，獲得了三倍體植株，并通過試驗確定了不同成熟期胚挽救的取樣時期可以根據母本品種成熟期來確定。

2.4分子標記技術輔助無核葡萄育種

分子標記是DNA水平的標記，能夠穩定遺傳，可以反映生物個體和群體特性。由于常規育種中對目標性狀選擇耗時、費力且容易出現偏差，因此分子標記在葡萄育種中的應用將提高葡萄遺傳育種的效率和精確度，并可用于雜種后代的無核性、抗病性及抗寒性等品種的早期鑒定。有研究者先后采用RAPD方法及AFLP技術法對葡萄無核基因進行了研究。Scott等[7]首次利用AFLP技術對Flame seedless 的突變體進行早期鑒定。郭海江等[8]利用葡萄無核基因、抗黑痘病和抗炭疽病基因RAPD標記，對多個胚挽救雜交后代進行了抗病性輔助選擇。李金月等[5]對供試材料進行RAPD分子標記，以驗證供試材料的抗寒性。這些研究成果為分子標記輔助早期選擇無核葡萄育種提供了DNA依據。

3無核葡萄胚挽救育種的主要影響因素

3.1確定最佳胚挽救時期

為保證獲得雜交后的合子胚，一定要用假單性結實的無核葡萄作母本。在親本選擇時除保證無核性狀外，選擇并培育抗病、早熟大粒、抗逆性強等優良性狀是目前的育種方向。無核葡萄胚的發育受基因型的嚴格控制。不同品種，甚至同一品種的不同植株，同一植株的不同部位，其胚發育期的長短是不同的。因此，研究胚敗育的過程，確定胚珠接種的最佳時期是胚挽救成功的前提[8]。有研究者通過無核葡萄與有核葡萄胚挽救雜交后代的抗寒性研究，證實了葡萄抗寒性具有母性遺傳現象。因此，在進行葡萄的抗寒性雜交選育中，一定要注意親本特別是母本的選配[5]。

3.2培養基及激素的選擇

無核葡萄胚挽救中選擇適宜的培養基是獲得成功的關鍵環節。在胚挽救過程的不同培養階段所選用的基本培養基類型不同。在胚珠培養階段，大多數研究者認為Nitsch 或NN 為胚發育的基本培養基效果良好，并經過多年研究總結出了適合無核葡萄胚珠培養的ER培養基。在胚萌發和成苗培養階段，多數研究者認為1/2MS 或Wood Plant（WP）培養基較好。經研究比較ER和Nitsch 兩種固液雙層胚珠發育培養基對胚珠萌發的效果，結果發現后者更適宜于無核葡萄雜種胚的萌發和胚狀體發生[9]。因此，在胚挽救過程中，注意基本培養基應隨著胚的不同發育階段而進行及時更換。在胚挽救中，無核葡萄胚珠培養適合在較高的銨態氮的培養基上，在培養基中適當添加活性炭和0.2~0.5mg/L的BA對無核葡萄的胚珠發育有促進作用。為打破胚的休眠，可加入適宜濃度的GA和IAA取代低溫處理。誘導分化階段可加入6－BA和NAA。在幼胚生長中，附加碳水化合物如葡萄糖和果糖等，既可提高培養基的滲透壓，還可為胚的發育提供能量，對胚性生長有利，但后期胚的萌發需降低滲透壓。切開胚珠可以改善胚與培養基之間的物質交流，橫切的胚珠培養萌發率最高[10]。此外，培養條件的設置對于胚挽救也有一定的影響。如合適的溫度、適量的光照及培養基適宜的pH值都是胚挽救成功的重要條件。有研究說明，常溫、黑暗比低溫、光照更有利于胚珠的發育[3]。

4結語

胚挽救技術作為一種高效育種技術，在無核葡萄的品種選育中得到了廣泛地應用且進展迅速，不僅極大地拓寬了葡萄育種的范圍和效率，更縮短了育種周期，推動了葡萄育種的進程。但是，這項技術還存在較多的不足，如雖然胚挽救技術較成熟，但葡萄無核性狀的遺傳規律理論研究較少；應用于遠緣雜交育種，供選群體無核性狀來源少且育種效率低，對不同無核葡萄的基因型還缺乏調節機制研究；對不同葡萄無核品種的適宜接種時期以及幼胚營養水平和培養條件深入研究不夠；無核葡萄育種與常規有核雜交育種和分子輔助標記選擇技術結合不緊密等。因此，立足已有的研究基礎，胚挽救技術結合現代生物技術將會大大地提高優良無核葡萄品種的選育效果，而精確的基因定位技術和進一步完善并充分發揮無核葡萄胚挽救技術體系，是今后研究努力的方向。

5參考文獻

[1] 劉三軍，蒯傳化，于巧麗，等.葡萄無核性狀遺傳與胚挽救技術的研究及應用[J].果樹學報，2009，26（1）：71-76.

[2] 程和禾，吳雅琴，趙艷華.奧迪亞無核葡萄胚挽救技術研究[J].河北農業科技，2008，12（11）：30-32.

[3] 唐冬梅，蔡軍社，駱強偉，等.用于無核葡萄選育的胚挽救技術研究[J].果樹學報，2008，25（3）：316-321.

[4] 閆愛玲，張國軍，徐海英.葡萄不同倍性品種的雜種胚挽救及鑒定[J].北方園藝，2008（7）：28-30.

[5] 李金月，王飛，王躍進.無核葡萄與有核葡萄胚挽救雜交后代的抗寒性研究[J].西北植物學，2008，17（6）：113-118.

[6] 郭印山，郭修武，張海娥.葡萄二倍體和四倍體雜交胚挽救的影響因素[J].果樹學報，2006，23（1）：115-117.

[7] SCOTT K D，ALLETT E M，LEE L S.AFLP markers distinguishing an early mutant of Flame seedless grape[J].Eupytica，2000（113）：245-249.

[8] 郭海江，王躍進，張劍俠，等.葡萄抗病無核胚挽救育種及分子標記輔助選擇[J].西北植物學報，2005，25（12）：2395-2401.

[9] 程琳琳，王躍進，石艷，等.無核葡萄胚挽救影響因素的研究[J].西北植物學報，2007，27（7）：1317-1322.

[10] 王飛，王躍進，周建錫.無核葡萄與中國野生葡萄雜種的胚挽救技術研究[J].園藝學報， 2006，33（5）：1079-1082.