慢性腎小球腎炎動物模型制作及其形態學的改變

張　暉　周酈楠　張　維　劉永林

在我國北方是慢性腎小球腎炎疾病發病率較高的地區，近年來，隨著人民的物質生活水平的不斷提高，慢性腎小球腎炎的發病率占有相當大的比重。迄今為止，尚無十分有效的治療，因此，研究其發病機制、防治措施具有重要意義。

本實驗建立的動物模型可為臨床治療該疾病提供實驗室動物實驗模型條件。為臨床研究新藥物提供實驗室可靠的理論依據。

1 資料與方法

1．1 實驗材料 雄性Wistar大鼠 中國醫科大學動物室提供；LUZEX-F顯微圖像分析儀（日本，松下公司）；日立H-600透射電鏡；恒冷箱切片機（日本）。

1．2 實驗動物分組 本實驗選用雄性Wistar大鼠60只，體質量260~300 g，隨機分成3組。

空白對照組：20只（`10只用于電鏡染色，10只用于電鏡觀察）；慢性腎小球腎炎模型光鏡組：60只；慢性腎小球腎炎模型電鏡組：20只。

1．3 實驗方法

1．3．1 經典慢性腎小球腎炎模型制備^[1]①L型菌誘發選用家兔，急慢性腎小球腎炎患者3 ml血，除去血漿，生理鹽水洗3次，低滲鹽水0．25%處理4 h，0．2 μm微孔濾膜負壓抽濾，高滲肉湯或牛肉湯培養基與L型菌培養基生長的細菌收集。健康白兔2~2．5 kg，1000萬左右細菌耳緣靜脈注入，隔日一次，共8次，30 d后生腎炎;②靜脈注射基底膜血清加脂多糖制基底膜抗原：BALB/c小鼠200只，處死取腎皮質，在孔徑105 μm的不銹鋼篩網上輾成勻漿后，用125 μm，75μm濾膜重疊過濾，留存于75 μm濾膜過濾的生理鹽水中漂洗。收集后超聲粉碎低溫離心，沉淀于2 ml生理鹽水；抗血清制備：2 ml抗原加4 ml福氏完全佐劑，多點注射，3、5、6周同樣方法強化，7周測滴度，1C∶C8時取血清。血清0．5 ml，（1C∶C4稀釋）小鼠尾靜脈注射，24 h后0．04 mg脂多糖注射；③異種血清法雄性大鼠：福氏完全佐劑1 mg和陽離子化牛血清白蛋白3 mg（C-BSA等電點8．6）背部皮下多點注射為予免疫，兩周后正式免疫；1、2周給C-BSA3 mg，3~4周給C-BSA5 mg，分別用pH704，0．01 mol/LBSA稀釋至1 ml，1次/d，靜脈注入。

1．3．2 實驗組慢性腎小球腎炎模型制備 筆者將經典的慢性腎小球腎炎模型簡化，選用雄性大鼠皮下注射：福氏完全佐劑1 mg和同種大鼠腎組織的勻漿液0．5 ml，1次/d。

1．3．3 光鏡組動物模型取材 對實驗動物用1%戊巴比妥鈉（40 ml/kg）腹腔麻醉后開胸，經左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時剪開右心耳。繼用0．1M磷酸鹽緩沖液（PBS,pH=7．4）配制的固定液（含4%多聚甲醛）灌流固定。取出實驗動物的大腦組織，放入含4%多聚甲醛的固定液中進行后固定大約2 h，之后將實驗動物的腎組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經水包埋，恒冷箱連續橫切片，片厚20 μm。

1．3．4 尼氏染色方法^[2]冰凍切片吹干，經PBS漂洗5 min×3次，將切片置入1%甲苯胺藍溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min×3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1．3．5 透射電鏡組模型取材 實驗對照組大鼠在1%戊巴比妥鈉（40 ml/kg）腹腔麻醉下，經左心室灌注含1%肝素鈉的生理 鹽水300 ml快速沖洗后，用2%多聚甲醛及2．5%戊二醛的0．1 mol磷酸緩沖液250 ml灌流固定，灌流后立即取腎，將組織塊置于4℃，2．5%戊二醛中固定24 h，再經1%鋨酸固定1 h后，常規脫水，包埋，L.K.B超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，日立H-600透射電鏡觀察并拍片。

2 實驗結果

2．1 尼氏染色結果 在空白對照組切片中可見腎組織的細胞質呈藍色，細胞形態正常，細胞數量較多，排列緊密，胞漿內尼氏體豐富；而在慢性腎小球腎炎模型光鏡組中可見腎組織受損細胞，細胞數量減少，細胞排列紊亂，細胞形態改變，腫脹或皺縮，細胞壞死崩解，溶解成碎片。

2．2 電鏡超微結構觀察 在空白對照組切片中可見細胞的細胞膜、細胞核及細胞質中的細胞器均為正常；而在慢性腎小球腎炎模型電鏡組中可見受損細胞出現明顯的損傷性改變：核皺縮，核膜部分溶解消失、線粒體腫脹、嵴紊亂甚至缺失、線粒體出現空泡樣變，內質網擴張、粗面內質網脫顆粒；高爾基復合體擴張，突觸數量減少、前后膜融合、突觸小泡不清或出現聚集。

3 結論

根據尼氏染色和透射電鏡結果證明慢性腎小球腎炎模型制備成功。該模型的制備不僅為基礎醫學研究提供了可靠的動物模型，更為藥物臨床治療慢性腎小球腎炎提供可靠的實驗室依據。該動物模型的建立成功，簡化了以往經典的實驗室動物模型的煩瑣，更為簡捷易操作，不僅節省實驗費用，更為新藥開展治療慢性腎小球腎炎提供良好的實驗室基礎。

參 考 文 獻

［1］ 施新猷.現代醫學實驗動物學.人民軍醫出版社，2000:473-474.

［2］ 梁曉俐.病理學基礎與實驗技術.軍事醫學科技出版社，2004:129-130.