原花青素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷抗炎機(jī)制研究

王　峰　郭　健

【摘要】 目的 研究原花青素（GSP）對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷抗炎作用機(jī)制。方法 大鼠腦缺血再灌注模型完成后，缺血2 h再灌注24 h，其中原花青素大劑量組(40 mg/kg)、小劑量組(10 mg/kg)術(shù)前7 d分別腹腔注射2 ml/kg GSP，模型組腹腔注射2 ml/kg生理鹽水，1次/d，再灌注前15 min加注1次。觀察不同劑量的原花青素對(duì)腦組織一氧化氮（NO）含量、髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性和腦組織神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果 原花青素可顯著減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的行為評(píng)分；顯著降低腦組織中NO含量和MPO的活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；ICAM-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。結(jié)論 原花青素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，作用機(jī)制之一可能與其抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】原花青素；腦缺血再灌注損傷；細(xì)胞間粘附分子-1；髓過(guò)氧化物酶；一氧化氮

The study of anti-inflammatory mechanisms of procyanidin on cerebral ischemia reperfusion injury of rats

WANG Feng,GUO Jian

【Abstract】 Objective To investigate the Anti-Inflammatory mechanisms of grape seed procyanidin (GSP) on cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI) of rats.Methods The model of MCAO was established by intraluminal suture technique.After 2 h of occlusion and 24 h of reperfusion，The high dose GSP (40 mg/kg) group and low dose GSP (10 mg/kg) group.was injected by intraperitoneal injection for 7 days ，and all groups were given a more time in 15 minutes before operation.The contents of NO and activities of MPO in brain tissue of ischemic hemisphere were measured; the expression of ICAM-1 in the cortex were measured by immunohistochemical method.Results The neurological scores of rats treated with GSP was reduced apparently compared with model group rats (P<0．05); there were apparent reduction of the contents of NO and marked decrease of MPO in GSP group compared with the I/R model group(P<0．05); compared with I/R model group，the expression of ICAM-1 was down-regulated obviously in GSP group (P<0．05).Conclusion GSP could relieve the cerebral ischemia reperfusion injury，one of the mechanisms could be the Anti-Inflammatory effect of procyanidin

【Key words】Procyanidin;CIBI;ICAM-1;NO;MPO

原花青素是一類從葡萄籽中提取出的天然植物多酚化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、抗炎、減輕缺血再灌注損傷^[1]降低血小板凝聚^[2]等保護(hù)作用。本試驗(yàn)研究目的旨在探討GSP在體內(nèi)對(duì)腦缺血再灌注損（CIRI）傷的保護(hù)作用及抗炎機(jī)制，從而為臨床腦保護(hù)藥物的研制和開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 健康Wistar大鼠64只，體質(zhì)量250~300 g，雄性，由山東魯抗集團(tuán)動(dòng)物中心提供。原花青素：天津尖峰天然產(chǎn)物研究公司（批號(hào)：G050804）提供，ICAM-1免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，一氧化氮(NO)試劑盒、髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。德國(guó)賀利氏儀器公司PRIM-R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)；日本OLYMPUS公司BH-2型生物光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)；日本Sanyo公司 MDF-330型立式超低溫冰箱等。

1．2 模型制備 采用改良Koizumi法制作大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，手術(shù)過(guò)程中用加熱墊和燈泡保持大鼠體溫。手術(shù)在30 min內(nèi)完成，缺血2 h后，將栓線抽出再灌注24 h，恢復(fù)MCA供血。

1．3 神經(jīng)功能評(píng)分 參考Zea Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

1．4 標(biāo)本制備及指標(biāo)測(cè)定 斷頭取缺血側(cè)的半暗帶皮質(zhì)備用。電子天平稱取腦組織塊約0．1 g，冰冷生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙拭干，加入Tris緩沖液用玻璃勻漿器制成10%的腦組織勻漿4℃離心3 500轉(zhuǎn)/min，15 min，取上清液進(jìn)行NO、MPO的測(cè)定。取缺血側(cè)半暗帶區(qū)皮質(zhì)于固定液中固定，用于免疫組化樣本的制作。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用多個(gè)樣本比較方差分析，P<0．05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1 GSP對(duì)大鼠CIRI后神經(jīng)功能的影響 GSP大、小劑量組都能改善大鼠神經(jīng)功能障礙癥狀，肌力表現(xiàn)增強(qiáng)，其行為評(píng)分與模型組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。

2．2 GSP對(duì)大鼠CIRI后腦組織NO、MPO含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織NO含量MPO活性顯著增高，GSP大、小劑量組可顯著降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織血清中NO、MPO含量，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2．3 GSP對(duì)大鼠CIRI后缺血半暗帶腦組織ICAM-1表達(dá)的影響 與模型組比較，GSP大劑量組ICAM-1表達(dá)表達(dá)明顯降低，可見(jiàn)少量細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒，陽(yáng)性表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于模型組，且大劑量組較小劑量組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1、2。

3 討論

NO通過(guò)超氧自由基(O^-₂)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，生成強(qiáng)氧化劑硝基陰離子(ONOO^-)，后者可導(dǎo)致級(jí)聯(lián)式神經(jīng)損傷； 髓過(guò)氧化物酶(MPO)主要存在于中性粒細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞被激活后，可通過(guò)脫顆粒作用釋放一種重要的髓過(guò)氧化物酶即MPO到胞外或吞噬小體內(nèi)，催化H₂O₂生成一系列具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的活性氧分子從而介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)表明，GSP用藥組顯著減低大鼠腦組織中MPO活性、NO含量，顯示GSP提高腦組織清除氧自由基能力，減輕氧自由基介導(dǎo)的炎性反應(yīng)對(duì)腦組織產(chǎn)生的一系列損傷，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

在正常情況下腦組織內(nèi)僅非常少量的ICAM-1表達(dá)，但在腦缺血等病理情況下，ICAM-1的表達(dá)明顯上調(diào)，它能夠介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的載附，促使白細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集和浸潤(rùn)，引起血管收縮，降低血流量，加重腦缺血；同時(shí)還可釋放自由基、蛋白水解酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，導(dǎo)致缺血細(xì)胞的進(jìn)一步損傷^[4-5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與模型組比較，GSP用藥組顯著減低大鼠腦組織中ICAM-1的表達(dá)，且大劑量組較小劑量組作用明顯，提示GSP提高腦組織的抗炎性從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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