高住低訓對骨骼肌蛋白質合成的作用及機理

摘要：研究目的：模擬高住低訓，測試并分析大鼠血睪酮、骨骼肌睪酮、骨骼肌ARmR—NA表達、骨骼肌總蛋白含量、骨骼肌MHC含量的變化，探討高住低訓，尤其是高住低氧對骨骼肌蛋白質合成的作用及其機理。研究方法：健康雄性SD大鼠40只，隨機分為4組：常氧安靜組、低氧暴露組、常氧運動組、高住低訓組。常氧安靜組在常氧環境下安靜生活，低氧暴露組晚上在常壓低氧帳篷中低氧暴露12 h，常氧運動組白天在常氧環境中進行耐力運動1 h，高住低訓組在白天進行1 h耐力運動后，晚上在低氧帳篷中進行低氧暴露，運動和低氧暴露的方式和時間分別同常氧運動組和低氧暴露組。在實驗第28 d取材測試指標。研究結果：1)常氧運動組比常氧安靜組骨骼肌總蛋白質含量升高，有顯著性差異(P<0.05)，MHc含量明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)。2)低氧暴露組比常氧安靜組血睪酮和骨骼肌睪酮含量下降，均有顯著性差異(P<0.05)。3)高住低訓組比常氧運動組血睪酮、骨骼肌睪酮含量明顯降低，骨骼肌總蛋白含量和MHc含量下降，均有顯著性差異(P<0.05)，腓腸肌濕重和體重明顯下降，有顯著性差異(P<0.05)。4)各組骨骼肌睪酮含量的變化趨勢與血睪酮的變化基本一致。結論：1)本研究選用的耐力運動模型有效地促進了骨骼肌蛋白質的合成代謝，在此基礎上進行低氧暴露模擬高住低訓研究骨骼肌蛋白質合成的調控是可行的。2)運動后進行低氧暴露降低睪酮水平，抑制蛋白質合成，可能是骨骼肌重量和體重下降的一個主要原因。3)血睪酮濃度在一定程度可反映骨骼肌睪酮含量的變化。

關鍵詞：低氧；低氧運動；睪酮；ARmRNA；MHc含量

中圖分類號：G 804.7文章編號：1009—783X(2009)05—0612—04文獻標志碼：A

高住低訓(living high-training low，HiLo)是美國學者萊文在高原訓練基礎上提出的一種低氧訓練模式，近年來的研究報道主要集中在對影響有氧代謝能力諸因素的研究。高住低訓主要用于耐力項目運動員提高有氧運動能力，高住低訓期間運動員白天進行耐力訓練，肌肉蛋白質分解增加，合成減少，存在蛋白質凈降解現象，耐力運動后蛋白質以合成代謝為主，蛋白質合成增強的趨勢一直持續到第2 d訓練之前。運動員白天進行耐力訓練后，晚上在低氧環境中休息是否抑制運動后骨骼肌蛋白質合成?高住低訓是否可以避免高住低氧對骨骼肌的負面作用?這些都直接關系到運動員訓練后的恢復、運動員力量、速度素質的保持或提高，所以為了全面完整地把握高住低訓對機體作用的規律，尤其是高住低氧對蛋白質合成的影響是一個急待探討的問題。

因對運動員實施肌肉活檢很困難，所以本研究以大鼠為研究對象，利用一個促進骨骼肌蛋白質合成的耐力運動訓練模型，模擬高住低訓，觀察低氧和運動是否影響血睪酮水平，通過血睪酮影響骨骼肌睪酮含量、雄激素受體基因表達，最終影響骨骼肌蛋白質的合成，為了進一步證實低氧和運動對骨骼肌收縮功能的影響，本研究還測試了骨骼肌中肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)的含量，試圖為高住低訓期間運動員運動能力和肌肉力量保持和提高提供理論依據。國內外未見高住低訓對骨骼肌蛋白質合成及作用機制的研究報道。

1 研究方法

1，1實驗對象與分組

健康雄性、2月齡SD大鼠40只，體重180～200 g，隨機分為4組：常氧安靜組、低氧暴露組、常氧運動組、高住低訓組，每組各10只。北京大學醫學部實驗動物科學部SPF級動物房中飼養。溫度22℃～26℃，濕度30％～58％，自由進食及飲水。

常氧運動組和高住低訓組先進行適應性跑臺訓練1周，然后進行正式實驗4周，各組的生活、運動和低氧暴露方式具體見表1。

1，2測試樣本采集與處理

第28 d各組動物出低氧帳篷后分別用25％烏拉坦麻醉后腹主動脈取血處死，常規制備血清，置于-80℃冰箱保存?？焖偃〕鐾炔康碾枘c肌，剔除脂肪和筋膜，用預冷的生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重，投入液氮中保存。

1，3指標測試與方法

1，3，1血睪酮

采用天津九鼎睪酮放免試劑盒，取標準品和血清樣品按照試劑盒的操作步驟進行加樣，利用美國Beckman DP5500型r計數儀直接讀出樣品濃度。

1，3，2骨骼肌睪酮含量

稱取40 mg的腓腸肌，用眼科小剪迅速剪碎，按1：4的比例加入組織勻漿介質，勻漿20 sX3次，勻漿速度為13 000rpm，然后4℃，20 000 rpm離心20 min，取上清于-80℃儲存待測。

采用北京華英HY-020睪酮放免試劑盒，取標準品和待測樣品按照試劑盒的操作步驟進行加樣，利用GC-911-r計數儀直接讀出樣品濃度。

1，3，3骨骼肌ARmRNA表達

首先以TrizolTM提取總RNA，M—MLV逆轉錄酶反轉錄為eDNA。以genebank上提供的AR mRNA基因序列(序列號：NM_012502)及D—aetm mRNA序列(序列號：NM_031144，)為模板，以primer premier 5.0軟件設計引物，采用TaKaRa Ex Taq(R)R—PCR Version 2.1，在ABI Prism7300型熒光定量PCR儀上進行擴增。以ABl7300 system soft—ware軟件對數據進行分析，計算方法使用比較CT法相對定量，目的基因表達量＝2(CT內參－CT目的)。

1，3，4骨骼肌總蛋白質含量

采用PIERCE公司BCA蛋白測試試劑盒，按試劑盒說明進行測試。

1，3，5骨骼肌MHC含量

稱取腓腸肌樣品40 mg，加TE緩沖液進行冰浴勻漿。高速低溫離心(4℃，13 000 rpm)30 min后，用紫外分光光度計測定蛋白濃度。取樣在Power 1000電泳儀進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：分離膠濃度為8％，濃縮膠為5％。樣品通過濃縮膠時電壓60 V，分離膠時為90 v。利用美國ImageQuant ECI，凝膠成像分析系統采集圖像，使用Im—ageMaster 2D Platinum軟件進行半定量分析。

1，4數據統計方法

所有數據均以“平均數±標準差”表示，用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，各組之間均數比較用單因素方差分析。P<0.05，顯著性差異，P<0.01，非常顯著性差異。

2 結果與分析

本實驗中常氧運動組骨骼肌蛋白質含量增加，體重、骨骼肌重量降低符合耐力訓練的一般規律，是機體對耐力訓練的一種適應性反應。常氧運動組血睪酮比常氧安靜組略降低，無顯著性差異，說明大鼠經過適應性訓練后對此負荷有了良好的適應，每天1 h的跑臺訓練是有利于蛋白質合成的，這與大多數耐力訓練對血睪酮影響的報道是一致的。綜合常氧運動組骨骼肌總蛋白含量、血睪酮、體重、骨骼肌重量的變化，說明本實驗所采用的運動模型有效促進肌肉蛋白質的合成代謝，在此模型基礎上進行低氧暴露模擬高住低訓是可行的。

2，1低氧和運動對大鼠體重、骨骼肌重量的影響

低氧暴露組體重比常氧安靜組、常氧運動組明顯降低，均有顯著性差異(P<0.05)，高住低訓組比常氧安靜組、常氧運動組明顯降低，均有顯著性差異(P<0.05)。低氧暴露組和高住低訓組之間比較無顯著性差異，結合常氧運動組體重的變化，考慮低氧會抑制體重的增長。

低氧暴露組和高住低訓組的腓腸肌濕重比常氧安靜組明顯降低，均有顯著性差異(P<0.05)。各組大鼠腓腸肌濕重的變化與體重的變化是一致的，說明單純低氧暴露和高住低訓使體重下降的原因是減少肌肉重量，損失的是瘦體重。

這與很多研究報道是一致的：低氧訓練降低體重主要是降低了瘦體重、肌肉的質量等等。游泳運動員在模擬2 800m海拔高度的低壓低氧艙內(12～13 h)高住低訓3周后，高住低訓組與常氧安靜組相比體重和瘦體重顯著降低，結合血清皮質醇和血尿素明顯升高，說明高住低訓促進蛋白質分解增加使瘦體重降低，而瘦體重降低是體重下降的主要原因。張紅品利用低氧帳篷模擬海拔2 800 m(低氧暴露為12 h／d)對大鼠進行高住低訓的研究結果提示：單純低氧刺激對大鼠體重影響很大，甚至大于常氧大負荷運動，低氧加運動負荷的雙重刺激對體重的影響更大，原因可能有以下幾方面：低氧環境使大鼠基礎代謝率增高，胃腸道對營養物質的吸收受損；骨骼肌蛋白質合成受阻，使骨骼肌重量下降；脂肪動員和分解加速。低氧大強度組體重增幅低于中負荷組，與常氧常氧安靜組比較有顯著性差異，提示在“高住低訓”模式下，運動強度越大，對體重的負性影響越大。

2，2低氧和運動對大鼠骨骼肌總蛋白質含量、血睪酮、骨骼肌睪酮的影響

本實驗以大鼠腓腸肌為樣本，腓腸肌以快肌纖維為主，對睪酮的變化最敏感，蛋白質是骨骼肌的重要組成成分，測試腓腸肌總蛋白含量能總體上反映骨骼肌蛋白質的代謝，能較好地反映低氧和運動經睪酮環節是如何影響骨骼肌的蛋白質合成，進而影響骨骼肌的收縮機能和肌肉力量。

常氧運動組大鼠骨骼肌總蛋白質含量比常氧安靜組明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)，比高住低訓組明顯提高，有顯著性差異(P<0.05)。常氧運動組骨骼肌總蛋白質含量的變化說明了28 d耐力運動雖然沒有改變骨骼肌的重量，卻增加了骨骼肌總蛋白質含量，反映對耐力運動的良好適應。低氧暴露組比常氧安靜組略高，說明單純間斷性低氧暴露對蛋白質含量影響不大。高住低訓組的骨骼肌總蛋白含量最低，與常氧運動組比較，說明每天運動后進行低氧暴露還是在一定程度上抑制了蛋白質的合成。高住低訓組蛋白質含量的變化與體重、腓腸肌濕重的變化是一致的，說明運動后進行低氧暴露抑制體重增加的原因之一在于抑制肌肉重量，而肌肉重量減少主要是因為低氧抑制了運動后骨骼肌的蛋白質合成。

低氧暴露組和高住低訓組血睪酮比常氧安靜組明顯下降，均有顯著性差異(P<0.05)，與體重、腓腸肌濕重的變化是一致的，結合常氧運動組的變化，說明低氧降低血睪酮水平可能抑制骨骼肌重量、瘦體重、體重的增長。高住低訓組血睪酮最低，與低氧暴露組相比，無顯著性差異，常氧運動組相對于常氧安靜組，并沒有引起血睪酮的明顯變化，推測高住低訓降低血睪酮主要是運動后低氧暴露造成的。

低氧暴露組腓腸肌睪酮濃度比常氧安靜組降低，有顯著性差異(P<0.05)，高住低訓組比常氧安靜組降低了33.3％，但無顯著性差異(P>0.05)。各組骨骼肌睪酮含量的變化趨勢與血睪酮的變化基本一致，高住低訓組骨骼肌睪酮含量與常氧安靜組比較無顯著性差異可能與標準差大有關。說明血睪酮濃度可以反映骨骼肌睪酮含量的變化。

運動后進行低氧暴露降低骨骼肌總蛋白質含量的原因可能是：低氧抑制蛋白質合成、加快蛋白質分解，其中主要是抑制蛋白質合成，可能主要是由于促合成激素的變化或缺氧直接抑制了蛋白質的合成。睪酮是促進骨骼肌蛋白質合成和肌肉生長最主要的激素。

低氧暴露導致血睪酮降低的主要原因是低氧可以抑制睪酮合成：長期低氧暴露(3 500 m左右)抑制下丘腦一垂體一性腺軸，抑制睪丸間質細胞內睪酮合成酶的活性，促進糖皮質激素分泌，糖皮質激素在下丘腦一垂體一睪丸3個環節影響睪酮的分泌。

除了雄激素之外，蛋白質合成代謝還受生長激素、胰導素等激素通過P13K、MAPK途徑調節。有學者報道了2 km和5 km的慢性連續低氧激活SS，顯著抑制GH—IGF-1軸，從而顯著抑制大鼠體重的增長，這種抑制作用·直持續整個低氧過程。結合本研究同期實驗28 d高住低訓組IGF-1、胰島素的變化，說明單純低氧暴露、高住低訓使蛋白質含量比常氧安靜組、常氧運動組減低的另一可能機理是低氧降低血清中IGF-1和胰島素水平。

Sandrine等人報道了低氧直接抑制蛋白質合成：大鼠肝細胞在5％氧濃度的低氧環境中孵育120 mtn后，細胞內ATP、RNA和蛋白質合成分別明顯降低了62％、82％和93％。Victor R等人測試了大鼠體內心肌、骨骼肌、肝臟、陘骨、皮膚、大腦、腎、肺等各種組織在10％氧濃度中低氧暴露6 h后，蛋白質合成速率降低了15％～35％。

近幾年關于低氧直接抑制蛋白質合成的機理主要集中在蛋白質的翻譯環節：低氧通過抑制mRNA翻譯的起始步驟而快速抑制蛋白質的合成，低氧抑制翻譯是通過兩個不同的機理介導的：第一個是通過磷酸化并抑制真核起始因子elFEa，PERK激酶可磷酸化這個因子；低氧抑制翻譯的第二個機理是使第二個真核起始復合物elF4F失活。低氧很快并且持續的抑制了mRNA翻譯，在1 h急性低氧暴露后蛋白質合成速率降低了60％～70％，隨后復氧可使蛋白質合成很快恢復到常氧水平。低氧使蛋白質合成減少并不是通過HIF途徑，而是通過氧傳感途徑直接抑制mRNA翻譯的起始步驟，低氧通過抑制mTOR途徑的4e-BP1和eEF2降低乳腺上皮細胞的蛋白質合成。

2，3低氧和運動對大鼠骨骼肌ARmRNA水平的影響

在骨骼肌中，睪酮通過影響蛋白質合成、分解和蛋白質凈生成或凈消耗的量來刺激肌肉生長，這些作用都是通過AR介導的臨床研究顯示氧甲氫龍治療5 d后明顯提高ARmRNA表達和肌肉蛋白質合成。T可能通過增加AR表達提高了肌肉蛋白質合成，誘導骨骼肌細胞肥大，TAR信號途徑增加了肌肉蛋白質合成、瘦體重、肌肉重量和肌肉力量。本研究各組ARmRNA表達無明顯差異，而低氧暴露組、高住低訓組血睪酮水平與ARmRNA水平的變化并不一致，類似的研究報道也顯示血睪酮降低的同時并不影響骨骼肌ARmRNA水平：Marcas觀察到人體在一次急性向心或離心運動后，血清睪酮沒有升高反而下降，但肌肉中ARmR—NA含量卻明顯升高。Matsakas A等人觀察12周跑籠訓練對大鼠3種不同骨骼肌(腓腸肌、股外側肌、比目魚肌)中ARmRNA表達和皿清睪酮的作用，RT-PCR結果顯示在任何肌肉中訓練組和常氧安靜組ARmRNA表達比較均無顯著性差異，酶免分析顯示與常氧安靜組相比，訓練組血清睪酮水平顯著降低，這些結果顯示長期訓練使大鼠血清睪酮水平降低，但并不影響骨骼肌中ARmRNA水平。張文棟的研究顯示：9周高負荷耐力常氧運動組股四頭肌組織睪酮承平顯著降低，而ARmRNA表達仍明顯高于常氧安靜組，認為9周高負荷常氧運動組強度相對較大，運動時間較長，外周骨骼肌組織攝取和消耗睪酮量增加，引起股四頭肌組織睪酮水平降低，為保證骨骼肌組織功能，抑制蛋白降解，ARmRNA表達一定程度代償性升高，促進AR蛋白合成，是機體一種保護性反應。

2，4低氧和運動對骨骼肌MHC含量的影響

低氧暴露組MHC含量比常氧運動組明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)，比高住低訓組降低，有顯著性差異(P<0.05)。常氧運動組比常氧安靜組明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)，比高住低訓組升高，有顯著性差異(P<0.05)。

有關低氧和運動對骨骼肌MHC影響的研究報道很不一致，大多集中在低氧或運動對MHC組成及不同異形體之間轉化的作用，關于低氧和運動對骨骼肌總MHC含量影響的報道很少。低氧暴露組大鼠骨骼肌MHC含量明顯低于其他3組，與常氧安靜組相比，無顯著性差異，說明對低氧暴露是逐漸適應的。常氧運動組的變化進一步說明本實驗的耐力運動訓練模型能顯著提高骨骼肌中收縮蛋白的含量，高住低訓組比低氧暴露組提高MHC含量，但由于低氧作用的因素，高住低訓組MHC含量顯著低于常氧運動組。說明運動后進行低氧暴露比單純運動抑制蛋白質的合成，降低蛋白質含量和MHC含量。高住低訓組MHC含量的變化與骨骼肌蛋白質含量的變化不同，比常氧安靜組略高，顯著高于低氧暴露組(P<0.05)，說明運動后進行低氧暴露相對于單純低氧暴露而言，對收縮蛋白含量的影響不大，是否還存在其他的作用機制，仍有待進一步探討。

3 結論

1)本研究選用的耐力運動模型有效促進骨骼肌蛋白質的合成代謝，在此模型基礎上進行低氧暴露模擬高住低訓是可行的。

2)高住低訓組各指標的變化，說明運動后進行低氧暴露降低睪酮水平，抑制蛋白質合成可能是導致體重、肌肉重量降低的原因之一。

3)血睪酮濃度在一定程度上可反映骨骼肌睪酮含量的變化。

4)睪酮水平的變化并不能完全解釋骨骼肌總蛋白含量的變化，說明低氧和運動通過TAR途徑的其他環節調節骨骼肌的蛋白質代謝，還有待進一步探討。

5)ARmRNA表達比較無明顯差異，推測可能與低氧和運動對AR表達的調節主要在翻譯環節。采點時間單一有關。

6)高住低訓組MHC含量的變化與骨骼肌蛋白質含量的變化不同，說明運動后進行低氧暴露對收縮蛋白含量影響不大，具體機制還有待進一步探討。