西瓜抗病毒ＲＮＡｉ植物表達載體的構建

摘 要：為了研究轉化同一種病毒的不同基因在轉基因西瓜中引發RNA沉默的效果以及利用RNA沉默培育抗多種病毒的策略，以pFGC5941為骨架質粒，分別構建了ZYMV cp、nib和Hc-Pro基因的反向重復植物表達載體pFIRzYMVCP、pFIRZYMVNIb和pFIRZYMVHc-Pro；利用重疊延伸PCR的方法，首先構建了含有CMV cp、WMV cp和ZYMV cp部分基因片段的CWZ cp三價基因，采用該三價基因構建了cWZ cp基因的反向重復植物表達載體pFIRCWZCP。研究首次在國際上構建了西瓜轉基因抗病毒RNAi植物表達載體，為探討RNA沉默在轉基因抗病毒西瓜中的應用奠定了基礎。

關鍵詞：西瓜；病毒病；RNA沉默；植物表達載體

中圖分類號：S651 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-525-07

小西葫蘆黃化葉病毒(Zucchini yellow mosaicvirus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaicvirus，WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和番木瓜斑駁病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)等的大發生嚴重制約了西瓜產業的發展，尤以ZYMV、WMV和CMV發生最為普遍和嚴重，造成了重大的經濟損失。生產上缺乏有效的防治措施，因此有效地控制西瓜病毒病的發生與危害是西瓜持續生產發展的保障，利用抗病品種是最為可行的途徑，通過轉基因創制抗病毒新種質可以克服傳統育種所遇到的障礙。RNA沉默技術已被證實是植物抗病毒的一種新策略。

轉錄后基因沉默(post transcriptional gene si-1encing，PTGS)也稱為RNA干擾或RNA沉默，是轉錄后mRNA產生的特異序列降解的機制。PTGS最初是Napoli等在矮牽牛上發現的，轉基因和同源的內源基因在轉化植株中的表達同時受到抑制。利用含有大麥黃矮病毒(Barleyf20W dwarf virlus，BY-DV)PAV株系的復制酶基因片段構建成可產生發夾式RNA結構的載體，并將該載體導入大麥得到強抗性植株且可穩定遺傳。Kai等證實包含TMV部分eDNA序列的反向重復轉基因煙草對TMV具有很好的抗性。最近，Kamachi等將黃瓜綠駁斑點病毒的外殼蛋白基因的ihpRNA載體導入煙草，誘導RNAi的產生，使煙草獲得了對該病毒的抗病毒性，證實煙草抗黃瓜綠駁斑點病毒是通過RNA沉默引起的，并且這種抗性是很高效的，為進一步獲得抗CGMMV的黃瓜或西瓜奠定基礎。基于這些研究，我們在西瓜上研究RNAi介導的抗病毒效果，以期通過轉基因培育抗病毒西瓜新種質。

為了分析同種病毒的不同基因與RNAi介導的基因沉默是否有關，評價不同基因對于西瓜抗病毒病的效果，構建了ZYMV外殼蛋白基因cp(coat pro－tein)、ZYMV復制酶基因nib和ZYMV Uc-Pro蛋白酶基因(helper component-proteinase，HC-Pro)的反向重復表達載體，以期分析這些基因在轉基因西瓜中引發的RNA沉默效果，為進一步培育抗病毒西瓜新種質提供理論依據。我們為培育抗多種病毒病的轉基因西瓜新品系，重組了分別含有CMV、WMV和ZYMV cp保守區域的三價CMZ cp基因，構建了CMZ cp基因的反向重復表達載體pFIRCWZ CP，期望分析轉3種病毒CMZ cp基因的西瓜植株對于3種病毒的抗病毒效果，為培育具有抗多種病毒的西瓜新品系奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

植物表達載體pFGC5941為骨架質粒，由CaMV 35S啟動子驅動，章魚堿合成酶基因的終止子(OCS 3′)，目標基因正反向片段插入位點之間由長約1.4 kb的矮牽牛查爾酮合酶A基因內含子(CHSA intron)隔開。pZYMV CP、pZYMV NIB和pZYMV Hc-Pro的質粒為本實驗室所有：DH5a為本實驗室保存的菌株；各種限制性內切酶購自MBI公司；TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自TAKARA公司；引物在英駿公司合成。

1.2 構建ZYMVCP、nib和Hc-Pro基因片段的植物表達載體引物

采用本實驗室保存的ZYMV外殼蛋白基因cp(登錄號：AY611025)、復制酶基因nib(登錄號：AY611023)和Hc-Pro基因(本實驗克隆還未登陸)，分別構建含有基因片段ZYMV cp，ZYMV nib和ZYMV Hc-Pro 3個反向重復植物表達載體。根據基因序列和載體上酶切位點，分別添加合適的限制性內切酶位點的引物(表1)。

在載體序列多克隆位點兩側分別設計2個引物，上游引物為：P5941-F：5′-GGA GAG GAC ACGCTC GAG TAT AAG AGC-3′。下游引物為：P5941-R：5′GCG ATC ATA GGC GTC TCG CAT ATC TC-3′，這2個引物之一與基因片段其中一個引物組合，可以確定基因片段的插入方向。反應擴增體系為25 μL，擴增條件為：94 ℃ 5min后，94℃30 s、64℃40 s、72℃40 s 30個循環，72℃10min。擴增產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，按照回收試劑盒說明書進行。

質粒雙酶切：2個限制性內切酶各1.0μL，10×Buffer緩沖液2.0μL，質粒4.0μL，補水至20μL，37℃水浴2 h。基因片段雙酶切：2個限制性內切酶各1.0μL，10×Buffer緩沖液2.0μL，含有合適酶切位點的基因片段10.0μL，補水至20μL，37 0c水浴2 h。連接體系：雙酶切后的質粒3.0μL，雙酶切后的片段10.0μL，T4 DNA連接酶1.0 μL，10×Buffer緩沖液2.0 IxL，補水至20“L，16℃反應12～16 h。連接產物轉化細胞DH5a，篩選陽性克隆，抽提質粒。

1.3 構建三價基因CWZ印植物表達載體的方法

1.3.1 獲得CWZ cp三價基因的引物和策略 利用DNAMAN軟件分別比對CMV、WMV和ZYM cp基因，選CMV cp(376 bp)、WMV cP(464 bp)和ZYMVcp(418 bp)基因的保守區域，利用重疊延伸PCR的方法獲得CWZcp三價重組基因片段1 258bp。表2為引物序列。

反應擴增體系為25μL，擴增條件同上。第1輪擴增以P1和P2為引物，以pCMV CP為模板得到CMV cp基因部分片段376 bp；以P3和P4為引物，以pWMV CP為模板擴增得到WMV cp基因的部分片段464 bp；以P5和P6為引物，以pZYMV CP為模板擴增得到ZYMV cp基因的部分片段418bp，擴增產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收。第2輪擴增的模板是第1輪擴增的回收產物，P1和P4以CMV cp和WMV cp作為模板擴增得到CMV-WMVcp；P3和P6以WMV cp和ZYMV cp作為模板，擴增得到WMV-ZYMV cp基因序列。第3輪擴增則用P1和P6為引物，以第2輪擴增的回收產物CMV-WMV cp和WMV-ZYMV印為模板，擴增得到含有CMV cp、WMV cp 和ZYMV cp 3個部分片段的CWZcp 3價重組基因片段1 258 bp(擴增策略見圖1)。并把該基因連入PMDl9-T載體中，轉化細胞DH5a，將轉化細胞涂布在含有50 mg·L^-1。氨芐霉素，100μL(20 g·L^-1)X-gal和20μL(100 g·L^-1)IPTG的LB平板培養基上進行藍白斑篩選，篩選陽性克隆，提取質粒pCWZCP。

1.3.2 構建CWZ cp三價基因植物表達載體的引物分析基因序列和載體序列，引入合適的酶切位點反向片段的引物序列pCWZCP-Fh 5′-TTGGCGCGCC G A G TCT TGT CG C AGC AAC-3′，劃線為AscI位點：pCWZ CP-R1 5′-CATG CCATGGTTC AGT GTC TTC GCT AGT-3′，劃線為NcoI位點。添加有合適的酶切位點正向片段的引物序列：pCWZCP-F2：5′CG-GGA-TCC GAG TCT TGT CGC AGCAAC-3′，劃線為BamHI位點；pCWZ CP-R2：5′-TCCCCCGGG TTC AGT GTC TTC GCT AGT-3′，劃線為Sinai位點。

2 結果與分析

2.1 pFIRZYM V CP、pFIRZYMV NIB和pFIRzYMV Hc-Pro植物表達載體的構建

為了研究ZYMV病毒的不同基因由RNA介導的沉默效果，構建了不同基因的反向重復植物表達載體。

對載體PFGC5941和擴增的含有SmaI和Xbal酶切位點的ZYMV cp基因片段分別進行SmaI和XbaI雙酶切。回收、連接轉化后，篩選陽性克隆，獲得pFSENZYMV CP質粒。進一步對pFSENZYMV CP質粒和含有NcoI和AscI酶切位點的ZYMV c基因片段用NcoI和AscI酶切。回收，連接轉化，篩選陽性克隆，獲得反向重復植物表達載體pFIRZYMVCP(圖2-A)。

分析nib和Hc-Pro基因序列后，在設計引物時引入了相同的酶切位點，因此nib和Hc-Pro基因的載體構建策略相同。對載體pFGC5941和擴增的含有SwaI和A scI酶切位點的ZYMV nib和ZYMVHe-Pro基因片段進行SwaI和AscI酶切。回收、連接并轉化，篩選。獲得含有反向片段pFASENZYMVNIB和pFASENZYMV Hc-Pro質粒。進一步對pFASENZYMV NIB和pFASENZYMV Hc-Pro質粒和含有BamHI和XbaI酶切位點的ZYMV nib和ZYMVHe-Pro基因分別BamHI和XbaI酶切。回收，連接并轉化，篩選陽性克隆，獲得反向重復表達載體pFIRZYMV NIB和pFIRZYMV He-Pro(圖2-B)。

2.2 pFIRZYMV CP植物表達載體的鑒定

PCR擴增以pFIRZYMV CP質粒為模板，用基因片段上游引物Pcp-F和載體序列下游引物P5941-R擴增，同時用基因片段上游引物Pcp-F和載體序列上游引物P5941-F擴增(圖3-A)，擴增結果和設計的片段大小一致，表明該質粒已含有正向和反向基因片段。用XbaI與Smal雙酶切pFIRZYMV CP質粒獲得正向基因片段：A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV CP質粒得到反向基因片段(圖3-B)，酶切成功表明該質粒中確實含有ZYMVcp基因的正向和反向基因片段。

PCR擴增和雙酶切鑒定表明成功構建了pFIRZYMV CP反向重復表達載體。

2.3 pFIRZYMV NIB植物表達載體的鑒定

PCR擴增以pFIRZYMV NIB質粒為模板。用基因片段上游引物Pnib-F和載體序列下游引物P5941-R擴增，同時用基因片段上游引物Pnib-F和載體序列上游引物P5941-F擴增(圖4-A)，擴增結果和設計的片段大小一致，表明該質粒已含有正向和反向基因片段。用XbaI與BamHI雙酶切pFIRZYMV NIB質粒得到正向基因片段，A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV NIB質粒獲得反向基因片段(圖4-B)，分別酶切得到和擴增結果一致的片段。表明該質粒中含有ZYMV nib基因的正向和反向片段。

PCR擴增和雙酶切鑒定表明成功構建了pFIRZYMV NIB反向重復表達載體。

2.4 pFIRZYMV He-Pro植物表達載體的鑒定

PCR擴增以pFIRZYMV He-Pro質粒為模板，用基因片段上游引物PHc-Pro-F和載體序列下游引物P5941-R擴增，用基因片段上游引物PHc-Pro-F和載體序列上游引物P5941-F擴增(圖5-A)，擴增結果表明該質粒已含有正向基因片段和反向基因片段。用XbaI與BamHI雙酶切pFIRZYMV He-Pro質粒得到正向基因片段，A scI與NcoI雙酶切pFIRZYMV He-Pro質粒得到反向基因片段(圖5－B)，酶切結果表明該質粒中含有ZYMV Hc-Pro基因的正向和反向基因片段。

2.5.2 pFIRCWZ CP植物表達載體的構建 以質粒pCWZ CP為模板，分別用兩端各帶有2個酶切位點的引物DCWZ CP-F1和oCWZ CP-R1，pCWZ CP-F2和pCWZ CP-R2擴增CWZ cp基因。對載體pFGC5941和擴增含有BamHI和SmaI位點的CWZcp基因片段分別雙酶切。回收連接并轉化篩選陽性克隆。獲得CWZ cp正向基因片段的pFSENCWZ CP質粒。進一步對pFSENCWZ CP質粒和含有NcoI和AscI酶切位點CWZ cp基因片段雙酶切。回收，連接并轉化，篩選陽性克隆。獲得反向重復植物表達載體pFIRCWZ CP(圖7)。

2.5.3 pFIRCWZ CP植物表達載體的鑒定PCR驗證時以質粒pFIRCWZ CP為模板，以基因片段上游引物pCWZ CP-F1和載體序列上游引物P5941－F擴增，同時用基因片段上游引物pCWZ CP-F2和載體序列下游引物P5941-R擴增(圖8-A)，分別擴增出和我們設計的大小一致的片段。表明該質粒已含有正向和反向基因片段。用BamHI和Sinai雙酶切pFIRCWZ CP質粒獲得正向片段：NcoI和AscI雙酶切pFIRCWZCP質粒獲得反向片段(圖8-B)，表明該質粒中已含有正向和反向基因片段。

PCR擴增和雙酶切鑒定都表明成功構建了pFIRCWZ CP反向重復植物表達載體。

3 討 論

通過構建反向重復植物表達載體，轉基因在植物體內形成dsRNA，引發病毒同源基因發生RNA沉默從而使植物獲得抗病毒性。研究表明表達載體構建的方式與基因沉默的效果有關，正反向重復目的基因被內含子隔開時，其產生RNA沉默的效率最好，可以達到100％，而只有正向基因或者只有反向基因的轉基因植株由RNA沉默介導的抗病性比含有內含子的反向重復表達載體低很多，只達到4％～30％的沉默效果。為了分析同種病毒不同基因RNA介導的抗病毒效果，本研究首先選擇了危害西瓜最嚴重的ZYMV作為研究對象，構建了ZYMVcp、nib和Hc-Pro基因反向重復植物表達載體。期望獲得具有抗病毒的轉基因西瓜新種質。利用RNA沉默原理，把病毒的cp基因，nib基因和Hc-Pro基因㈣的正向或反向基因片段導入植株中，研究轉基因植株的抗病毒效果已有很多。在本研究中，不是延用前人的做法只是導入正向或反向基因，而是構建同時含有一個基因的正向和反向序列且這2個序列被內含子隔開的反向重復表達載體，這樣有利于在植物細胞內形成穩定的dsRNA，從而有效攻擊病毒基因組的同源片段，使病毒RNA降解，達到較好的基因沉默效果，進而能很好的比較3個基因對于植物的抗病毒效果，最終獲得抗病毒轉基因西瓜新品系。

針對目前我國西瓜生產種植中的多種病毒危害的特點，選擇了危害西瓜的ZYMV、WMV和CMV 3種病毒的外殼蛋白基因作為研究的對象，重組了同時含有CMV、WMV和ZYMV cp的部分基因序列的三價CWZ cp基因。在選擇3個片段連接起來的方法上，分析發現如果利用酶切位點連接片段要經過多次的酶切和連接，使實驗程序變得復雜；且基因序列和載體上的酶切位點不能滿足多次的酶切和連接需要，因此我們利用重疊延伸PCR技術互相嵌套的方法將3者組合一起。利用重疊延伸PCR技術需要進行3輪PCR擴增才能獲得目的基因，考慮到多次擴增及普通Toa DNA聚合酶易出現堿基改變的特性，在擴增CWZ cp基因時采用了高保真pyrobestDNA聚合酶擴增。該基因測序結果發現有1個堿基突變，這和在Taq DNA聚合酶進行終止子區段的改造時也發現過4堿基變化是一致的。推測是DNA聚合酶擴增時帶來的堿基變化，因為構建的是反向重復片段的載體，所以推測1個堿基變化不影響發卡結構的形成。在重組了三價CWZ cp基因后，構建了CWZ cp基因的由內含子隔開的反向重復表達載體。力求在不改變原品種優良性狀前提下，期望選育出兼抗3種病毒的西瓜新品系，為開發抗3種病毒的西瓜資源提供理論依據，為培育具有多種抗性的西瓜新品系奠定基礎。本研究構建的植物表達載體已轉入農桿菌LBA4404和BH105中，西瓜遺傳轉化及抗病毒鑒定工作正在進行中。

致謝：感謝武漢大學生命科學學院郭德銀教授和廈門出入境檢驗檢疫局陳紅運老師的學術建議和山東農業大學植物保護學院竺曉平老師提供pFGC5941載體!