基于Ｔａｑ Ｍａｎ ＭＧＢ探針的李痘病毒分子檢測

摘要：李痘病毒(Plum pox virus，PPV)是我圍對外檢疫性有害生物。研究根據該病毒不同分離株外殼蛋白(coatprotein，CP)基因的保守序列，設計了特異性引物與熒光探針，建立了基于Taq Man MGB分子探針的PPV實時熒光RT-PCR檢測方法。方法特異性研究表明，針對PPV的2個主要流行株系M株系與D株系，均能夠得到典型擴增曲線，ct值分別為14.96和18.22；而對于馬鈴薯Y病毒、李屬壞死環斑病毒以及桃叢簇花葉病毒等其他毒株則沒有典型擴增曲線，也無Ct值。靈敏度比較發現，該方法比雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法的靈敏度提高1 000倍，具有快速、靈敏和高特異性的優點，適合對PPV的檢測。

關鍵詞：李痘病毒：TaqMan MGB探針；實時熒光RT-PCR；檢測

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-581-04

李痘病毒(Plum pox virus，PPV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，主要侵染李屬木本植物，能夠引起葉片扭曲、褪綠，葉脈黃化，降低果實的產量和品質。PPV在歐洲曾使感病品種的產量損失80％～100％。在自然條件下，PPV的傳播主要依賴蚜蟲以非持久方式傳播，遠距離擴散途徑則主要通過感病植物繁殖材料的調運。目前，PPV在國內未見有分布的報道，是我國新頒布的進境植物檢疫性有害生物。

針對李痘病毒的檢測已有生物學、血清學與RT-PCR方法。隨著分子生物學檢測技術的發展，實時熒光RT-PCR(Real-time nuorescent RT-PCR)以其具有的高特異性、高靈敏度以及快速的優點越來越多的應用于疫病的檢測。它的原理是在常規PCR的基礎上，加入一條特異性的熒光探針，隨著探針的水解與信號的積累，從而實現對特異性產物的定性與定量分析。

普通TaqMan熒光探針的Tm值為65～72℃，片段長度為25～40 nt，由于其高特異性的特點，如果探針與目標基因序列沒有完全匹配，則會發生檢測效率低甚至沒有熒光信號的產生等問題。因此，對于不同株系或分離物變異較大的病毒而言，由于難以設計長片段的完全匹配合適的熒光探針，就必須采用-TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探針技術。Taq—Man MCB探針由于3′端具有MGB分子，提高了探針的Tm值，從而使探針長度縮短，以滿足整個熒光RT—PCR的檢測條件。

根據GenBank(http：／／WWW.ncbi.nlm.nih.gov)中的序列比對結果，李痘病毒各分離物外殼蛋白基因的同源性為87％～99％，序列中堿基變異比較多且分散，無法設計得到完全匹配的長片段TaqMan探針。因此，建立基于TaqMan MGB探針的李痘病毒實時熒光RT-PCR檢測技術，以期為出入境檢疫部門與相關研究機構提供一項靈敏、穩定的病毒快速檢測技術，防止國外危險性有害生物傳入我國。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

李痘病毒的陽性物質M株系(PPV-Marcus)和D株系(PPV-Dideron)均購自美國Agdia公司。樣品狀態為新鮮葉片經液氮處理，磨成粉末狀，冷藏于4 ℃冰箱保存。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y.PVY)、香蕉苞片花葉病毒(Banana bract mosaicvirus，BBrMV)、小麥線條花葉病毒(Wheat streakmosaic virus，WSMV)、李屬壞死環斑病毒(Prunusnecrottc ringspot virus，PNRSV)以及桃叢簇花葉病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)等陽性物質也都購自美國Agdia公司。

PPV的雙抗體夾心酶聯(DAS-ELISA)檢測試劑盒購自美國Agdia公司。

熒光探針與引物由上海基康生物公司合成，One Step RT-PCR Kit(Peffect Real Time)與DL-2000Marker購自TaKaRa公司。實時熒光PCR儀為ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀。

1.2 樣品制備

PPV陽性物質按照說明書要求加入樣品提取液，充分混勻后，2 000 r·min^-1離心lO min，上清為病毒原液。

取50 txL病毒原液加入到450 μL健康桃葉提取液中，混勻后，得到10^-1倍稀釋的含病毒樣品。再從中取50μL加入到450μL健康桃葉提取液中，得到10^-2稀釋度的含病毒樣品，以此方法，分別得到10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀釋度的含病毒樣品。健康桃葉提取液為不含病毒的陰性樣品。

取不同稀釋度的含病毒樣品分成2份，每份體積100μL，一份樣品經RNA提取后用于實時熒光RT-PCR檢測靈敏度研究，另一份樣品直接用于DAS-ELISA靈敏度檢測，測試方法參照試劑盒說明書，當樣品D_405nm≥2×陰性DD_405nm時，樣品被判定為陽性，即攜帶有病毒。

1.3 病毒RNA提取

采用Trizol試劑方法提取

1.4 引物與探針設計

引物與探針的序列見表1。引物擴增片段預期為64bp；探針5′端含有FAM熒光報告基團，3′端含有不發熒光的淬滅基團并具有MGB分子。

1.5 實時熒光RT-PCR擴增

實時熒光RT-PCR擴增體系參照One StepPrimeScrip^TMRT-PCR Kit(Peffect Real Time)說明，反應體系為：2×One Step RT-PCR BufferlII 10 μL；RNase free dH₂O 6 μL；上下游引物(20 p，mol·L^-1)各0.6μL；熒光MGB探針(20 μmdl·L^-1)0.6μL；ROXreference dye(50×)0.4μL；TaKaRa EX Taq^TMHS(5U·μL^-10.4 μL；PrimeSeript^TM RT Enzyme Mixll 0.4μL；最后加入1μL的RNA模板，總體積20μL。每個樣品設一個平行反應，并設置陰性對照與空白對照。

反應程序為：42℃5min，95℃lO s：然后95℃5 s，60℃31 s，共40個循環。

1.6 結果分析

酶聯免疫反應結果在BIO-RAD 680型酶標儀上直接讀取D_405nm值。

實時熒光RT-PCR利用ABI 7000型熒光定量PCR儀自帶軟件SDS進行結果分析，根據陰性對照結果設定閾值線，擴增曲線及樣品Ct值由軟件自動生成。

2 結果與分析

2.1 探針的設計

為了獲得能夠檢測大多數或全部PPV分離株的引物與熒光探針，根據GenBank(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov)中已登錄的李痘病毒(D13751)的外殼蛋白基因序列，采用Blast程序進行同源性比較。結果顯示堿基變異多而分散。在部分序列的保守區，使用Primer Express 3.0軟件，設計得到既與目標序列完全匹配又能夠與引物配合完成整個熒光反應的TaqMan MGB探針(表1)。

2.2 PPV的實時熒光RT-PCR檢測結果

PPV檢測引物與熒光探針特異性研究顯示(圖1-A)，能夠以PPV的2個主要流行株系M株系和D株系RNA為模板，擴增得到典型曲線，其Ct值分別為14.96和18.22，而未能從PVY、BBrMV、WS—MV、PNRSV、PRMV以及健康桃葉提取液等樣本中得到典型擴增曲線，也無ct值。PPV與PVY、BBrMV以及WSMV同屬于馬鈴薯Y病毒屬，結合在NCBI中的同源性與特異性比較結果，表明這一對引物與熒光探針檢測PPV具有良好的特異性。同時，實時熒光RT-PCR擴增產物的凝膠電泳結果也顯示本研究設計的引物與熒光探針對PPV具有非常好的特異性(圖1-B)。

2.3實時熒光RT-PCR檢測PPV的靈敏度研究

PPV的不同濃度梯度樣品經實時熒光RT-PCR檢測后發現(圖2-A)，病毒原液以及10^-1～10^-4病毒稀釋液樣本均能夠得到典型擴增曲線，根據陰性對照設置閾值線，得到其Ct值分別是15.10、20.70、26.76、31.12和35.59。其中，10^-4病毒稀釋液的Ct值為35～40，經重復實驗，它們的Ct值仍然為35～40.根據判定原則鑒定為陽性。10^-5與10^-6病毒稀釋液樣本未得到Ct值，被判定為陰性。

實時熒光RT-PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖2-B)，10^-1-10^-4病毒稀釋液樣本均能夠得到1條分子量約64 bp大小的明亮擴增條帶，與陽性對照擴增產物大小相同。因此，根據瓊脂糖凝膠電泳判定的陽性結果與根據擴增曲線Ct值判定的陽性結果完全一致。

2.4 DAS-ELISA檢測結果

不同稀釋度的PPV病毒樣品經DAS-ELISA反應后，其結果見表2。可以看出，判定陽性結果的臨界D₄₀₅值為0.306，10^-1稀釋樣品液的D₄₀₅值為0.525，高于臨界D₄₀₅值，被判定為DAS-ELISA檢測陽性，而10^-2稀釋樣品液的D₄₀₅值為0.286，低于臨界D₄₀₅值，被判定為DAS-ELISA檢測陰性。因此，實時熒光RT-PCR檢測靈敏度要比DAS-ELISA方法靈敏度高出1 000倍。

3 討 論

通過PPV外殼蛋白基因的同源性檢索，結果發現PPV的株系較多，不同分離株的CP基因序列中堿基差異多且分散，采用Primer Express 3.0軟件未能設計得到合適的引物與TaqMan探針。因此，本研究采用了TaqMan MGB探針技術，解決了這一技術難題。

由于目前常用的PPV檢測方法是DAS-ELISA法，因此，本研究對建立的實時熒光RT-PCR方法與成熟的DAS-ELISA試劑盒方法靈敏度做了比較，結果顯示，實時熒光RT-PCR檢測靈敏度比成熟的DAS-ELISA方法靈敏度高1 000倍。這項研究結果有助于檢測人員對PPV檢測方法的選擇。

實時熒光RT-PCR方法是在普通RT-PCR基礎上的擴增，該方法同樣會產生RT-PCR擴增產物，經過瓊脂糖凝膠電泳顯示，通過產物判斷陽性的靈敏度與通過擴增曲線判定陽性的靈敏度結果一致。

植物病毒由于難于提純與體外培養，在實際樣品中的含量又普遍較低，尤其是本研究中的李痘病毒，其在木本植物不同部位的分布不均勻且含量低，因此，本研究建立基于TaqMan MGB分子探針技術的高靈敏度實時熒光RT-PCR方法，對于提高PPV的檢出率，防止該危險性病毒傳入我國具有很大的意義。