蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性測定

摘要：2007年8－10月從山東主要蘋果產區輪紋病果上分離獲得83個蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengriana f.sp.piricola)菌株，采用菌絲生長速率法分別測定了各菌株對多菌靈的敏感性。結果表明，多菌靈對83個菌株的EC₅₀值呈單峰頻次分布，分布在0.019 6～0.486 7mg·L^-1，均值為0.108 0±0.015 2mg·L^-1；在83個菌株中選擇對多菌靈最敏感的泰山海棠菌系進行重復測定，將其EC₅₀平均值0.042 8 mg，L^-1確定為蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感基線；通過Duncan氏新復極差法和系統聚類分析結果表明，不同地理來源的蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性都處在較高水平，總體上不存在明顯差異，沒有出現敏感性下降的抗藥性亞群體。

關鍵詞：蘋果輪紋病菌：多菌靈：敏感性基線

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2009)04-516－04

蘋果輪紋病 (Botryosphaeria berengriana f.sp.piricola)是近年來蘋果生產上危害最為嚴重的一種病害，不僅可以危害枝干，造成樹勢衰弱、枝干枯死，還能造成大量爛果，發病嚴重時田間病果率為70％～80％，且貯藏期可持續發病。給病發病率近年來呈上升趨勢，給果農帶來嚴重的經濟損失。施用化學殺菌劑是目前防治蘋果輪紋病的有效措施之一。其中以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑應用最為廣泛。但由于該類藥劑作用靶標單一，長期單一使用很容易使病原菌產生抗藥性而導致藥劑防效降低或喪失。馬志強等監測了河北保定郊區蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性，發現所測定的菌株對多菌靈均已普遍產生不同程度的抗藥性，但未發現高抗菌株。楊煒華等測定了部分縣市區蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性，發現多菌靈在0.05 mg·L^-1質量濃度下即能明顯抑制菌絲的生長，且測定的菌株均為低水平抗性菌株。山東省在防治蘋果輪紋病上連續多年使用多菌靈，但至今仍缺乏對該病菌抗藥性的研究報道。作者采用菌絲生長速率法，測定了多菌靈對山東不同地理來源的83個蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengriaria f.sp.piricola)菌株的毒力，建立了多菌靈對蘋果輪紋病菌的敏感性基線，為開展其抗性檢測與治理提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株的采集和分離 2007年8－10月，分別在魯東地區棲霞(Qx)、蓬萊(PL)、招遠(ZY)、魯中南地區沂源(YY)、蒙陰(MY)，魯西地區肥城(FC)、泰山(Ts)、冠縣(GX)、東阿(DE)，魯北地區惠民(HM)、陽信(YX)的不同行政區域且相距一定距離的果園內，隨機采集輪紋病果，裝入干凈的小塑料袋中(每個袋子只裝一個標本)，帶回實驗室分離純化后，共獲得83蘋果輪紋病菌株(Botryosphaeriaberengriana f.sp.piricola)。

1.1.2 供試藥劑 97％多菌靈(carbendazim)原粉由山東華陽科技股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養基的配制 先將97％多菌靈原粉溶于0.1 mol·L^-1的鹽酸溶液中，配成10 g·L^-1的母液，置4℃冰箱中備用，測定時，根據培養基的用量，用移液管吸取一定量的藥劑母液加入溶化并冷卻至50℃左右的培養基中，充分搖勻，配成含多菌靈系列濃度的含藥培養基。每處理重復4次，以不加藥劑為對照。

1.2.2 蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性測定 在PDA平板上培養(26℃，黑暗)4 d的參試菌株菌落邊緣打出直徑7 mm菌餅，分別移到含有多菌靈6個梯度濃度的PDA平板上，置26℃暗培養4 d，測定菌落徑向線性生長量，確定藥劑對菌落生長的抑制率。每處理(每菌株每濃度水平)重復4次。通過菌絲生長抑制概率值和藥劑濃度對數值之間的線性回歸分析，求出各藥劑對各供試蘋果輪紋病菌菌株的有效抑制中濃度(EC₅₀值)。

敏感性基線的確定方法，根據不同地區EC₅₀值測定結果，選擇未曾施用多菌靈的采自泰山南天門的敏感菌株，進行方差分析，剔除EC₅₀值差異達顯著水平的菌株，再重復測定差異未達顯著水平的系列菌株的EC₅₀值，以重復測定敏感菌株的EC₅₀值的平均值為敏感性基線。

試驗數據均由Microsoft Excel 2003、DPS數據處理工作平臺進行統計分析。

抑制生長率(％)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)／(對照菌落直徑一菌餅直徑)]x100

抗性指數=參試菌株EC₅₀值／本研究建立的敏感性基線EC₅₀值

2 結果與分析

2.1 蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性水平

2.1.1 蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性總體水平多菌靈對83個參試菌株的EC₅₀值均低于0.50 mg·L^-1，分布在0.019 6～0.486 7 mg·L^-1，均值為0.108 O±0.015 2 mg·L^-1，變異系數為0.652 7；其中，TS8為最敏感菌株(EC₅₀=0.019 6 mg·L^-1)，MY9最不敏感(EC₅₀=0.486 7 mg·L^-1)。從圖1可以看出，除PL2(EC₅₀=0.328 50 mg·L^-1)、MY8(EC₅₀=0.322 O mg·L^-1)、MY9(EC₅₀=0.486 7 mg·L^-1)以外的80個菌株的EC₅₀值呈單峰曲線，接近正態分布(圖1)。

2.1.2 蘋果輪紋病菌對多茵靈的野生敏感基線 在83個菌株中選擇對多菌靈比較敏感的泰山南天門蘋果輪紋病菌進行重復測定，其EC₅₀值的測定結果見表1。7個菌株的ECho值為0.019 6～0.070 3mg·L^-1.平均EC₅₀值為0.042 8±0.008 0 mg·L^-1。由于泰山南天門菌系是對多菌靈最為敏感的菌系，因此可將這個菌系7次測定的平均EC₅₀值0.042 8±0.008 0 mg·L^-1作為山東省蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性基線。

2.1.3 蘋果輪紋病菌不同地理茵株對多茵靈敏感性的差異 采用Duncan氏新復極差法檢驗了多菌靈對8個地理菌株系列EC₅₀值的差異顯著性。結果(表2)顯示，8個菌株系列之間EC₅₀均值無極顯著性差異，最高(PL，0.1607mg·L^-1)與最低(TS，0.042 8mg·L^-1)相差2.75倍；EC₅₀值的變異系數，最高(MY，0.949 0)與最低(QX，0.274 0)相差2.46倍。

2.1.4 不同地理來源菌株對多茵靈敏感性水平的系統聚類分析多菌靈對供試菌株EC₅₀值的離差平方和系統聚類分析結果(圖2)表明，83個菌株EC₅₀值可分為由高到低的5個聚類組，第l組包括3個菌株(MY8、MY9、PL2)，第2組包括10個菌株(HM3、HM17、HM20、HM22、YY1、YY3、YY6、YY14、PL^-1、QX6)，第3組包括24個菌株(Qx1、Qx3、Qx15、YY2、YY4、YY8、YY9，YY10、YY13、YY15、HM2、HM4、HM11、HM12、HM24、MY1、MY6、YX1、YX7、GT2、PY7、PL3、ZY3、GX2)，第4組包括29個菌株(HM8、HM9、HM1O、HM13、HM18、HM19，HM21、QX4、QX5、QX7、QX8、QX10、QX12、QX13、YY18、MY3、MY4、MY10、MY11、P16、PL9、FC2、FC3、YX4、YX8、TS1、TS6、DE3、DE8)，第5組包括16個菌株(YX6、DE1、DE2、DE4、DE5、DE6、DE7、DE1O、TS2、TS3、TS7、TS8、TS9、MY5、HM26、YY17)。所有聚類組均包括不同的菌株系列，表明蘋果輪紋病菌對多菌靈離體敏感性的地區性差異不明顯。其中，HM、YY、MY系列菌株出現在4個聚類組中，QX、PL、YX系列菌株出現在3個聚類組中，TS、DE系列菌株出現在2個聚類組中。由此表明，各系列菌株對多菌靈敏感性的變化程度，HM、YY、MY最大，均大于QX、PL、YX，TS、DE的變化幅度最小，而這些均與Duncan新復極差法的分析結果相對應。

2.2 蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性現狀

絕大多數參試菌株(96.39％)對多菌靈的EC₅₀值為0.019 6～0.208 5 mg·L^-1，相差9.64倍，均值為0.097 8±O.010 1 mg·L^-1，呈近正態的連續單峰頻次分布，僅有3.61％參試菌株(PL2、MY8、MY9 EC₅₀值分別為0.328 5 mg·L^-1、0.322 O mg·L^-1、0.486 7 mg·L^-1)呈不連續分布。敏感性差異顯著性檢驗結果及EC₅₀值離差平方和系統聚類分析結果均表明，不同地理來源的蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性總體上不存在明顯差異。因此，目前蘋果輪紋病菌對內吸性殺菌劑多菌靈的敏感性都處在較高水平，沒有出現敏感性下降的抗藥性亞群體。

3 討 論

利用化學農藥防治植物病害是植物病害綜合防治措施之一，具有見效快，防病效果好等優點，但如果長期施用單一殺菌劑，特別是內吸性殺菌劑，易使病原菌產生抗藥性。國外對苯并咪唑類殺菌劑引起植物病原菌產生抗藥性的報道很多，在我國河北保定關于蘋果輪紋病菌對多菌靈的抗藥性也有相關報道。山東省在防治蘋果輪紋病上也是連續多年使用多菌靈，但對是否已出現抗藥性，迄今尚無研究報道，本文研究了多菌靈對山東省不同地理區域的蘋果輪紋病菌離體抗菌活性。檢測結果表明，不同地理來源蘋果輪紋病菌對多菌靈離體敏感性存在著廣泛的(不一定達到統計學意義上的顯著性)差異。這與不同蘋果產區的蘋果種植年限、輪紋病的發生程度，當地農民的用藥水平有關。對來自8個蘋果產區77個菌株抗性的差異顯著性檢驗結果以及對來自11個產區83個菌株抗性的系統聚類分析結果均表明，不同地理來源的蘋果輪紋病菌對多菌靈離體敏感性總體上不存在顯著差異。這可能因為多菌靈常與代森錳鋅、福美雙等保護劑交替使用而減少了使用量有關。馬志強等測定了河北保定郊區，蘋果輪紋病菌對多菌靈的抗藥性水平，發現所測定的低抗、中抗菌株分別占63.6％、36.4％，未見高抗和特高抗菌株，而本實驗室測定的菌株的EC₅₀值均小于O.400 0mg·L^-1，僅有1株MY9菌株EC₅₀值達到O.486 7 mg·L^-1(抗性指數=11.37)，可見尚未有抗藥性亞群體出現。因此，山東省蘋果輪紋病菌，已經對多菌靈產生了一定的抗藥性，但抗藥性水平不高，目前仍可將多菌靈作為防治蘋果輪紋病菌的首選藥劑。

但由于低抗性菌株的存在，抗藥性群體在藥劑選擇壓力下會不斷發展，因此應結合本研究建立的敏感基線監測今后田間蘋果輪紋病對多菌靈抗性的發展情況，以便盡早采取能應對措施，避免在田間出現嚴重抗藥性問題。

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