楊梅種間雜交及雜種Ｆ₁的胚培養(yǎng)

摘要：在楊梅屬的楊梅種和矮楊梅種之間進(jìn)行了人工遠(yuǎn)緣雜交，然后對(duì)其雜交F₁代成熟種子作了胚培養(yǎng)研究，并用SSR分子標(biāo)記對(duì)雜種的真實(shí)性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，楊梅種和矮楊梅種有著較好的雜交親和性，以楊梅種為母本、矮楊梅種為父本的F-雜交種中，70.5％的種子胚正常發(fā)育；以矮楊梅種為母本、楊梅種為父本的F₁雜交種中，76.5％的種子胚發(fā)育正常。用Ms添加O.5 mg·L^-1的6-BA培養(yǎng)基對(duì)矮楊梅種(♀)×楊梅種(♂)和楊梅種(♀)×矮楊梅種(♀)2個(gè)F₁雜交組合以及楊梅品種晚稻楊梅(WD)、遲色(CS)等4份材料的胚培養(yǎng)中，綠苗誘導(dǎo)率分別為85.O％、28.6％、6.9％、0.0。在1/2MS添加O.5 mg·L^-1BA的生根培養(yǎng)基中，矮楊梅種(♀)×楊梅種(♂)和楊梅種(♀)×矮楊梅種(♀)F₁綠苗的生根率分別為29.2％和33.3％。SSR分子標(biāo)記對(duì)楊梅種(♀)×矮楊梅種(♂)F₁的鑒定表明雜交后代為真雜種。研究結(jié)果為楊梅育種提供了新的途徑，并為楊梅遺傳連鎖作圖研究的群體構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：楊梅；矮楊梅；種間雜交；雜種F₁；胚培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S667.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009－9980(2009)04-507-04

楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)是楊梅屬中的一個(gè)種，亞熱帶喬木果樹(shù)，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史。楊梅也是目前我國(guó)南方具有較好經(jīng)濟(jì)效益的特色果樹(shù)。但是，楊梅育種研究較為落后，長(zhǎng)期以來(lái)采用自然突變單株優(yōu)選的育種方法，品種改良速度緩慢，其果實(shí)儲(chǔ)藏性差、樹(shù)體高大、始果期長(zhǎng)等不利性狀亟待改良。矮楊梅(M.nana Cheval.)是楊梅屬中的另一個(gè)種，株高一般在2.0m以下，多為灌木類型，生長(zhǎng)周期比楊梅短，實(shí)生苗3 a后即有部分開(kāi)花，與楊梅種有著相似的開(kāi)花、結(jié)果習(xí)性，花期3月中旬至4月，果實(shí)6～7月成熟，不同生態(tài)類型果實(shí)大小、顏色不同，但多數(shù)果形小、果實(shí)可溶性固形物低。矮楊梅株高性狀是楊梅矮化育種的重要潛在基因來(lái)源。

為促進(jìn)楊梅育種的開(kāi)展，我們首次對(duì)楊梅種和矮楊梅種進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交研究，成功獲得了雜交F。代種子，并通過(guò)胚培養(yǎng)得到了F₁代苗。這一雜交的成功為矮化楊梅樹(shù)體提供了可能途徑，而胚培養(yǎng)體系的建立則為構(gòu)建楊梅遺傳群體、研究楊梅性狀的遺傳打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

楊梅種間雜交材料：矮楊梅(M.nana)雌、雄株各一個(gè)生態(tài)類型，以及楊梅種(M.nana)中的晚稻楊梅(M.rubra var.Wandao)品種、楊梅雄株一個(gè)基因型[外觀形態(tài)與遲色(M.rubra var.Chise)品種較為接近]。所用的矮楊梅雌、雄株為多年前由云南引種到杭州的2個(gè)植株。以矮楊梅為母本的雜交實(shí)施地點(diǎn)在杭州，以晚稻楊梅品種為母本的雜交實(shí)施地點(diǎn)在舟山。

楊梅胚培養(yǎng)材料：楊梅品種晚稻楊梅、遲色，以及矮楊梅♀×楊梅♂(M.nana×M.rubra)F₁、晚稻楊梅♀×矮楊梅♂(M.rubra cv.WD×M.nana)F₁。實(shí)驗(yàn)中所用的外植體均為成熟種子胚。

1.2 楊梅雜交

母本開(kāi)花前將雌花枝條進(jìn)行套袋隔離，并預(yù)先在雄花散粉前。剪下雄株枝條插于室內(nèi)裝有水的瓶中養(yǎng)護(hù)，散粉后將花粉收集到清潔容器中，雜交時(shí)打開(kāi)套袋口子，用毛筆蘸取花粉快速在雌花柱頭上涂抹一下，并立即將隔離紙袋口子封好，掛上標(biāo)簽，15 d以后察看結(jié)實(shí)情況，取下套袋，至果實(shí)成熟收獲種子。

1.3 胚培養(yǎng)

所用的4份材料在進(jìn)行胚培養(yǎng)以前其種子均在4℃冰箱中儲(chǔ)藏了25 d，然后用鐵錘敲碎外殼進(jìn)行離體胚培養(yǎng)。去除外殼的種子無(wú)菌水沖洗3次后，用70％乙醇浸泡30 s，再O.1％升汞滅菌4 min，最后無(wú)菌水沖洗5次，并用鑷子剝?nèi)シN皮后接種到添加0.5mg·L^-16-BA的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3周，種子發(fā)芽并轉(zhuǎn)綠為綠苗誘導(dǎo)成功，綠苗誘導(dǎo)率計(jì)算：(發(fā)芽種子數(shù)／接種種子數(shù))×100％。增殖培養(yǎng)基與初始培養(yǎng)基相同，每4-5周繼代1次。伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg·L^-1的6-BA和0.2 mg·L^-1的IBA，約培養(yǎng)4～5周。生根培養(yǎng)基為1／2MS添加0.5 mg·L^-1的IBA，培養(yǎng)4～5周。

1.4 真假雜種的SSR鑒定

所用SSR分子標(biāo)記為本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的楊梅基因組特異的SSR標(biāo)記，在本實(shí)驗(yàn)中我們篩選了2個(gè)多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記YMll (F-seq：TGTA-CATYFCCCAGGCCTFC.R-seq：TITAAAGTCCCCACGCTCAG)和YMl2(F-seq：CCTGGAGATGACGTTTTCGT，R-seq：ATTTGATCCTCGATCCGTTG)，對(duì)M.rubra cv，WDxM，nanaF₁雜種的真實(shí)性進(jìn)行初步鑒定。DNA直接從胚培苗中用CTAB法提取。判別方法：所測(cè)F₁單株兼具2個(gè)親本條帶的即記為真雜種，其它情形均為假雜種。SSR分子標(biāo)記檢測(cè)采用非變性丙烯酰胺凝膠電泳，然后AgNO₃染色。

1.5 煉苗及栽培管理

苗生根以后，移出培養(yǎng)基并置于濕潤(rùn)的培養(yǎng)瓶中，讓瓶蓋虛掩，放置于培養(yǎng)室中2～3 d，然后將根清洗干凈再轉(zhuǎn)移至人工基質(zhì)中培養(yǎng)，并先放置于溫室養(yǎng)護(hù)1周，最后轉(zhuǎn)至大棚中。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅和矮楊梅的雜交親和性及雜種F₁。當(dāng)代果實(shí)特性

以矮楊梅為母本、楊梅種雄株為父本進(jìn)行了人工雜交，共獲得了34顆雜交種，其中26顆種子的胚發(fā)育正常，胚正常種子占76.5％。當(dāng)代果實(shí)依然保持矮楊梅果實(shí)特點(diǎn)，平均單果質(zhì)量為5.6 g，可溶性固形物僅為7.8％，均顯著低于遲色品種。在以晚稻楊梅品種為母本、矮楊梅雄株為父本的雜交中，共獲得了30顆種子，其中19顆胚發(fā)育正常，占70.5％。當(dāng)代雜種果實(shí)平均單果質(zhì)量為7.7 g，與晚稻楊梅沒(méi)有顯著差異，但可溶性固形物為9.9％，顯著低于晚稻楊梅品種的10.8％(表1)。

2.2 楊梅種間雜交種F₁的胚培養(yǎng)

2.2.1 綠苗誘導(dǎo)培養(yǎng) 由于楊梅種子的外殼非常堅(jiān)硬，部分種子在破除殼過(guò)程中胚受到了損傷，在以矮楊梅為母本的雜交種中，最后獲得胚完整種子20顆，以晚稻楊梅為母本的雜交種中，胚完整的為14顆。初始培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg·L^-16-BA。結(jié)果遲色、晚稻楊梅、M.nanaxM.rubra F₁和M.rubra cv.WDxM.nana F₁等4份材料中，M.nanaxM.rubra F₁的綠苗誘導(dǎo)率為85.0％，M.0rubra cv.WDxM.nana F₁的綠苗誘導(dǎo)率為28.6％，晚稻楊梅品種的綠苗誘導(dǎo)率為6.9％，遲色品種的綠苗誘導(dǎo)率為O(表2，圖版-A～D)。

2.2.2 伸長(zhǎng)和根誘導(dǎo)培養(yǎng) 進(jìn)一步對(duì)獲得綠苗的3份材料晚稻楊梅、M.nana×M.RUBRA Fl、M.rubra cv.WD×M.nana F₁。進(jìn)行了增殖、伸長(zhǎng)和根誘導(dǎo)培養(yǎng)。在增殖培養(yǎng)過(guò)程中，晚稻楊梅僅有的2株綠苗因?yàn)樯L(zhǎng)不良沒(méi)有繁殖成功，17株M.nanaxM，rubra F₁綠苗中僅9株成功增殖，4株M. rubra cv.WD×M，nanaF₁綠苗中僅2株成功增殖。經(jīng)過(guò)伸長(zhǎng)培養(yǎng)，獲得了89株高度超過(guò)1.5 cm的M.nana×M.rubra F₁未生根苗和18株株M.rubra cv.WD×M.nana Fl未生根苗，然后用作生根培養(yǎng)。

在1／2MS添加O.5 mg·L^-1IBA的生根培養(yǎng)基中，M.nana×M.rubra F₁獲得生根苗26株，生根率為29.2％；M.rubra cv.WD×M.nana F₁獲得生根苗6株，生根率為33.3％(表3，圖版-A～F)。

2.2.3 種間雜交種雜種真實(shí)性的SSR分子標(biāo)記鑒定用YMll和YM122個(gè)多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記對(duì)獲得的M.rubra cv.WD×M.nana F₁的2個(gè)單株進(jìn)行了雜種真實(shí)性鑒定。結(jié)果M.rubra cv.WD×M.nana F₁的2個(gè)單株均含有雙親的多態(tài)性條帶(圖1)，所以可以基本確認(rèn)它們?yōu)檎骐s種。

2.2.4 胚培苗的養(yǎng)護(hù) 胚培苗的養(yǎng)護(hù)管理非常重要，若養(yǎng)護(hù)不當(dāng)苗的成活率會(huì)得不到保障。在本試驗(yàn)中，生根后的胚培苗進(jìn)行煉苗以后，被種植在裝有人工基質(zhì)(泥炭：珍珠巖=1：2)的盆缽中，再在培養(yǎng)室中過(guò)渡幾天，然后才移至大棚中養(yǎng)護(hù)，同時(shí)加強(qiáng)澆水管理。通過(guò)這一措施，胚培苗的成活率達(dá)到了100％(圖版－G)。

3 討 論

遠(yuǎn)緣雜交是楊梅種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。本研究表明楊梅種和矮楊梅種之間無(wú)論以哪一個(gè)為母本均有著良好的雜交親和性，這對(duì)研究矮楊梅的種質(zhì)利用和楊梅的品種改良將會(huì)有很大的幫助。

以晚稻楊梅品種為母本、矮楊梅為父本的雜交當(dāng)代果實(shí)，其可溶性固形物顯著低于晚稻楊梅品種，可能楊梅果實(shí)可溶性固形物這一性狀受到花粉直感效應(yīng)的影響，因?yàn)橄啾扔跅蠲贩N果實(shí)而言，矮楊梅的可溶性固形物要低得多。在果樹(shù)中，花粉直感現(xiàn)象普遍存在，有研究表明獼猴桃果實(shí)的多個(gè)性狀存在著花粉直感效應(yīng)，某些梨品種的可滴定酸、可溶性固形物等性狀也表現(xiàn)為花粉直感效應(yīng)。

楊梅的胚培養(yǎng)僅Asghar等曾作過(guò)研究，他們將楊梅種中的荸薺品種的成熟胚作為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加激素，成功獲得了胚培養(yǎng)苗。本研究在參考其研究結(jié)果基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基的配制上作了改良，并采用了不同的培養(yǎng)材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同品種或組合對(duì)相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基有著顯著不同的反映。類似現(xiàn)象在其它植物的胚培養(yǎng)中也有發(fā)現(xiàn)，如不同的父、母本品種對(duì)櫻桃遠(yuǎn)緣雜種的胚萌發(fā)和多叢芽誘導(dǎo)增值有顯著影響。相比于其他植物的胚培養(yǎng)，如甜柿，本研究胚培苗的根誘導(dǎo)率偏低，為此我們將進(jìn)一步改進(jìn)培養(yǎng)體系，以提高生根率。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)是鑒定真假雜種的有效手段，在種子純度檢驗(yàn)中已有廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)發(fā)及正在開(kāi)發(fā)的楊梅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記也將在楊梅的遺傳育種研究中發(fā)揮重要作用。

楊梅種與矮楊梅種遠(yuǎn)緣雜交及雜種的胚培養(yǎng)已獲得了初步成功，該技術(shù)體系的建立對(duì)研究楊梅種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義，同時(shí)，通過(guò)這一技術(shù)體系將為楊梅遺傳圖譜的研究進(jìn)而分析楊梅屬的遺傳進(jìn)化過(guò)程打下良好的基礎(chǔ)。(本文圖版見(jiàn)封2)

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