柑橘天然雜種秭歸橘橙來(lái)源探究

摘要：秭歸橘橙為天然柑橘雜種，果實(shí)無(wú)核、早熟，但其親本來(lái)源未得到深入的分析和驗(yàn)證。為探明秭歸橘橙的親本，應(yīng)用倍性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)標(biāo)記和AFLP、cpSSR、nSSR等分子標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行遺傳鑒定。倍性檢測(cè)證實(shí)秭歸橘橙為二倍體，葉形指數(shù)、氣孔密度和大小、花粉育性和花粉形態(tài)分析表明秭歸橘橙形態(tài)特征上偏向于甜橙，而其花粉染色活力介于甜橙與紅橘之間。AFLP聚類分析表明秭歸橘橙介于橙和橘之間。cpSSR、nSSR確認(rèn)秭歸橘橙的母本為甜橙(Citrus sinensis[L.]Osbeck)，父本為橘類(C.reticulate Blanco)。

關(guān)鍵詞：柑橘；天然雜種；橘橙；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2009)04-425-06

20世紀(jì)90年代以來(lái)，柑橘成為世界上第一大水果。我國(guó)柑橘業(yè)的迅猛發(fā)展與柑橘品種改良技術(shù)的進(jìn)步有著重要關(guān)系。拉開(kāi)成熟期是育種工作者的主要目標(biāo)之一。我國(guó)是柑橘資源大國(guó)，長(zhǎng)期的柑橘栽培以及各種類型混栽的現(xiàn)實(shí)導(dǎo)致大量的變異產(chǎn)生。從這些地方資源中選擇我們需要的類型，一直是柑橘育種的一條重要途徑。1998年，湖北省秭歸縣在該縣發(fā)現(xiàn)1株具有明顯雜種特征的柑橘，初步認(rèn)定為橘與橙的天然雜交種，當(dāng)?shù)囟麨轱鰵w橘橙。其果實(shí)外觀像橘，囊瓣像甜橙，具有甜橙風(fēng)味，果實(shí)無(wú)子，果皮、果肉均為橙黃色，果皮比甜橙易剝離，但比橘稍難；果實(shí)成熟期較早，一般9月下旬成熟。與當(dāng)?shù)卦耘嗟臏刂菝鄹獭⒛毘群推渌s柑品種相比，秭歸橘橙具有開(kāi)發(fā)成為特早熟雜柑優(yōu)良品種的潛力，但其親本來(lái)源尚未得到證實(shí)。我們旨在通過(guò)形態(tài)、細(xì)胞和分子標(biāo)記探索該雜種可能的親本來(lái)源，特別是利用近年開(kāi)發(fā)的葉綠體分子標(biāo)記追溯母本來(lái)源。SSR、AFLP等分子標(biāo)記是近些年開(kāi)發(fā)的一種遺傳標(biāo)記，具有遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高、檢測(cè)迅速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于資源研究中。過(guò)去的分子標(biāo)記多數(shù)是核標(biāo)記，要弄清母本的來(lái)源比較困難，最近Cheng等開(kāi)發(fā)了柑橘葉綠體SSR(cpSSR)引物，利用該引物可以有效地鑒定雜種的母本來(lái)源。

1 材料和方法

1.1 材料

為了解秭歸橘橙可能的親本，收集了在秭歸栽培歷史較久的普通甜橙品種，有錦橙、桃葉橙、哈姆林甜橙，收集的寬皮柑橘有溫州蜜柑、紅橘和金錢(qián)橘等，其栽培歷史都比秭歸橘橙悠久(表1)。選擇沙田柚[Citrus grandis(L)Osbeck]、HB柚[C.grandis(L.)Osbeck]和四季橘(C.madurensis Lour.)等品種作對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 倍性分析 倍性檢測(cè)采用細(xì)胞流式儀檢測(cè)(型號(hào)：PA-I，Partec公司，德國(guó))，參照張俊娥等的方法。取秭歸橘橙的嫩葉分析倍性，以二倍體紅橘葉片作對(duì)照。

1.2.2 形態(tài)學(xué)分析 隨機(jī)取秭歸橘橙、金錢(qián)橘、桃葉橙、紅橘和錦橙的春梢葉片各30枚作葉形指數(shù)(葉長(zhǎng)／葉寬)分析。然后將葉片的下表皮揭下制成壓片，在萬(wàn)能顯微鏡(Olympus，Dx-ucb，Japan)下觀察氣孔密度和大小。使用Image-pro 3DS 5.1軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的氣孔數(shù)，測(cè)量氣孔的長(zhǎng)與寬。每個(gè)品種隨機(jī)取3枚葉片，每片葉選取3個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)量10個(gè)氣孔。

1.2.3 花粉育性測(cè)定 花粉育性的測(cè)定采用醋酸洋紅染色法，隨機(jī)取秭歸橘橙、紅橘和錦橙各50朵花，共觀察500個(gè)花粉粒，做3次重復(fù)，具體步驟參考鄧秀新等描述的方法。

1.2.4 掃描電鏡觀察花粉形態(tài) 電鏡掃描步驟參照Feng等和 Mizukami等闡述的方法略有變化。成熟的花蕾固定在萬(wàn)能固定液中，然后在一系列梯度的酒精中脫水(30％，50％，70％，80％，90％，100％)，接著在異戊醇、醋酸混合液中培育1 h。待花粉粒干燥后噴金。封固好的標(biāo)本用掃描電鏡(Quanta 200)觀察拍照，電壓為30 kV。

1.2.5 基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用CTAB法提取葉片總DNA，具體方法參照Cheng等。DNA樣品的質(zhì)量和濃度用U-2800分光光度計(jì)(Hitachi，Japan)測(cè)定，濃度稀釋到25 mg·L^-1，在-20℃下保存。

1.2.6 AFLP擴(kuò)增與檢測(cè) AFLP分析反應(yīng)體系參照Vos等的方法進(jìn)行，從11對(duì)AFLP引物中篩選出能獲得條帶清晰、多態(tài)性高的2對(duì)引物組合(EA02-MC04、E04-MC05)，使用Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)在PTC-200熱循環(huán)儀(MJ Re-search，Watertown，MA，USA)上進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染法檢測(cè)，銀染法參照銀染試劑盒(Promega，Madison，WI)。

1.2.7 SSR擴(kuò)增與檢測(cè) 分別選用4對(duì)cpSSR引物(SPCC1、SPCC3、SPCC9、sPCC11)(表2)和4對(duì)nSSR(TAA1、TAA15、TAA27、TAA41)(表3)進(jìn)行cpSSR和nSSR分析，其擴(kuò)增與檢測(cè)分別參照Cheng等和Kijas等描述的方法進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理和AFLP聚類分析 對(duì)形態(tài)學(xué)分析和花粉育性測(cè)定的數(shù)據(jù)用SAS程序V8軟件進(jìn)行方差分析。

分別用1，0代表AFLP譜帶的有無(wú)，將原始數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)獲得矩陣。用NTSYS-PC2.10e軟件計(jì)算相似系數(shù)，獲得相似系數(shù)矩陣嘞，用其中SAHN程序和非加權(quán)類平均數(shù)方法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析”。

2 結(jié)果與分析

2.1倍性分析

流式細(xì)胞儀分析秭歸橘橙葉片的倍性，結(jié)果表明秭歸橘橙的倍性(圖1-A)和對(duì)照(圖1-B)一樣，是二倍體。

2.2形態(tài)學(xué)鑒定

秭歸橘橙的葉形指數(shù)比紅橘、錦橙的葉型指數(shù)小，且差異顯著，與哈姆林甜橙的葉形指數(shù)無(wú)顯著差異。秭歸橘橙的氣孔密度比紅橘、錦橙、哈姆林甜橙的氣孔密度都小，且差異顯著。秭歸橘橙與紅橘、錦橙、哈姆林甜橙相比氣孔最小，有顯著差異(表4)。由此可見(jiàn)，秭歸橘橙的葉片比橘和甜橙的葉片更圓，氣孔密度更低，且氣孔更小。

秭歸橘橙、紅橘和錦橙的花粉染色活力如表5所示。秭歸橘橙的花粉染色活力(44.0％)介于紅橘(71.1％)和錦橙(43.8％)之間，與紅橘的花粉染色活力有顯著差異，與錦橙的花粉染色活力無(wú)顯著差異。秭歸橘橙的花粉直徑比紅橘和錦橙的花粉直徑都大，差異顯著。

花粉形態(tài)的電鏡掃描圖見(jiàn)圖2。圖2顯示秭歸橘橙、錦橙、紅橘和金錢(qián)橘的花粉形狀相似，為近球形或近扁球形。圖2-c清楚的顯示它們均為網(wǎng)狀飾紋。秭歸橘橙和錦橙的飾紋很像，網(wǎng)脊線很寬，內(nèi)孑L橫長(zhǎng)，大小一致；而紅橘、金錢(qián)橘與秭歸橘橙的飾紋不一樣，網(wǎng)脊線特寬，內(nèi)孔圓形，大小不一致。因此推斷秭歸橘橙與錦橙有較近的親緣關(guān)系。

綜合葉型指數(shù)、氣孔密度和大小、花粉育性和花粉形態(tài)分析，秭歸橘橙形態(tài)特征上偏向于甜橙，而其花粉染色活力介于甜橙與紅橘之間。

2.3 分子鑒定

研究總共試驗(yàn)了11對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物，從中篩選出2對(duì)多態(tài)性高且條帶清晰的引物EA02－MC04(EA02：5’-GTAGACTGCGTACCAAT TC A-GA-3’.MC04：5’-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-GA-3’)和E04-MC05(E0 4：5’-GTAGACTGCG-TACCAATTCACT-3’.MC05：5’-GACGATGAGTC-CTGAGTAACAA-3’)。用這2對(duì)引物對(duì)7個(gè)柑橘材料進(jìn)行AFLP分析，共得到108條擴(kuò)增帶，其中多態(tài)性條帶46條，多態(tài)率42.6％。圖3顯示秭歸橘橙和甜橙的帶型很相近。通過(guò)AFLP聚類分析(圖4)可知秭歸橘橙處于紅橘和甜橙之間，其與甜橙的親緣關(guān)系最近，與橘的親緣關(guān)系其次，而與柚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

所試4對(duì)cpSSR引物中SPCCl和SPCC3能夠顯示出較好的多態(tài)性，能有效區(qū)分橘與甜橙或者橘與柚(圖5-A，B)。從圖中可以看出秭歸橘橙和桃葉橙、哈姆林甜橙、錦橙、沙田柚的帶型一致，而與紅橘、溫州蜜柑的帶型不同。由于柑橘中葉綠體DNA(cpDNA)為母性遺傳，所以秭歸橘橙的母本可能來(lái)自甜橙(或柚)。形態(tài)學(xué)分析和AFLP聚類分析都證明秭歸橘橙與甜橙有較近的親緣關(guān)系，因此可以認(rèn)為其母本是甜橙，但具體是哪個(gè)品種目前的手段尚得不出結(jié)論。

所試的4對(duì)nSSR引物中TAAl5能揭示分析樣品的多態(tài)性。如圖5-C所示，盡管秭歸橘橙在TAAl5上帶最少，但其同時(shí)具有桃葉橙、哈姆林甜橙、錦橙與紅橘的帶，說(shuō)明秭歸橘橙與甜橙、橘有較近的親緣關(guān)系。

結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果，我們推斷秭歸橘橙是以普通甜橙為母本，橘為父本的有性雜種。

3 討 論

作者首次應(yīng)用花粉形態(tài)等形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)合cpSSR等分子標(biāo)記鑒定柑橘有性雜種。花粉電鏡掃描結(jié)果表明，橘和甜橙的花粉飾紋存在一定的差異，這與藍(lán)盛銀等研究的結(jié)果一致。我們?cè)赾pSSR分析中發(fā)現(xiàn)甜橙和柚類胞質(zhì)來(lái)源相同，溫州蜜柑和橘類的胞質(zhì)來(lái)源相同，該結(jié)果與Brayan等舊用cpSSR分析柑橘及其近緣屬的遺傳多樣性的結(jié)論一致，與Li等應(yīng)用nSSR與cpSSR標(biāo)記研究中國(guó)本地寬皮橘品種和野橘遺傳多樣性的推斷相吻合。

據(jù)記載秭歸橘橙的母樹(shù)樹(shù)齡近50 a。哈姆林甜橙是上世紀(jì)70年代從美國(guó)引進(jìn)的甜橙實(shí)生變異，1965年引入我國(guó)。因此從引進(jìn)年份上排除了哈姆林甜橙是秭歸橘橙親本的可能性。從花粉染色活力和花粉群落電鏡掃描圖(數(shù)據(jù)未列出)可以看出，金錢(qián)橘、錦橙和秭歸橘橙的花粉敗育率較高，其中金錢(qián)橘的花粉幾乎全部敗育，而錦橙和秭歸橘橙的花粉敗育率達(dá)到了56％。由此可以認(rèn)為金錢(qián)橘為父本的可能性較小。我們?cè)谑诜蹖?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)授粉的秭歸橘橙果實(shí)有種子，而沒(méi)有授粉的秭歸橘橙果實(shí)沒(méi)有種子，初步推測(cè)秭歸橘橙為自交不親和，確切原因有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

致謝：感謝湖北秭歸縣柑橘良種示范園的宋文化場(chǎng)長(zhǎng)和廖勝才技術(shù)員為本試驗(yàn)提供部分材料。

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