泡菜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的克隆表達

吳長力，陳穎琪，陳桂柳，林夢哲，張宏梅

(廣東工業大學 生物工程系， 廣州 510006)

亞硝酸鹽廣泛存在于咸魚、腌制肉類和腌制蔬菜中，過量的亞硝酸鹽除了能與人體內蛋白質的降解物結合生成強致癌物質亞硝胺外，還可與血紅蛋白結合而造成正鐵血紅骯癥，對人體危害極大。有報道指出各地區亞硝酸鹽中毒事件逐年增加，所以食品中亞硝酸鹽的污染情況及其控制已成為食品安全相關領域研究的一大熱點[1-4]。在食品及其配料的亞硝酸鹽清除方法中，比較有效的降解方法是生物降解法。目前報道較多的是乳酸菌對發酵食品中亞硝酸鹽的降解，如Hashimoto等人在泡菜中添加乳酸菌，發現亞硝酸鹽含量明顯降低[5]；另外，在發酵食品如香腸、咸魚和泡菜中，已篩選出許多能降解亞硝酸鹽的乳酸菌株，如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、沙克乳桿菌(Lactobacillussakei)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等[6-8]。有關乳酸菌降解食品中亞硝酸鹽的研究機理表明, 這些乳酸菌在生物發酵后期, 主要通過亞硝酸還原酶來降解亞硝酸鹽。該酶是植物硝態氮同化過程中的一個十分重要的酶，所以，獲得來源豐富和高效的亞硝酸鹽還原酶是實現食品中亞硝酸鹽降解的重要途徑。

本研究前期在泡菜中分離了一株可高效降解亞硝酸鹽，并通過菌種鑒定的植物乳桿菌L10(LactobacillusplantarumL10)，在此基礎上，本研究通過基因工程技術，將植物乳桿菌中獲得的nirS基因導入到大腸桿菌中進行表達，并誘導產生重組亞硝酸鹽還原酶，旨在為該酶在食品安全領域中的實際應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

MRS培養基:購自青島海博技術有限公司；TaKaRa切膠回收試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA連接酶、限制性內切酶(Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ)：購自大連寶生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白質分子量Marker、pET-32a(+)表達載體、大腸桿菌BL21(DE3)：購自廣州鼎國生物科技有限公司。

實驗所用的植物乳桿菌(LactobacillusplantarumL10)從潮汕泡菜(購于廣東揭陽)中分離篩選所得；大腸桿菌DH5а為實驗室保存菌株；亞硝酸鹽還原酶基因引物序列為[9]：

NF 5′-GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG-3′(下劃線Bam H Ⅰ酶切位點)；

NR 5′-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG-3′(下劃線Xho Ⅰ酶切位點)。

pET-32a(+)質粒重組鑒定引物：

T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；

T7t：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′；

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1nirS基因的克隆

采用SDS-CTAB法提取植物乳桿菌的全基因組DNA，以其為模版用引物NF和NR對nirS基因進行擴增：反應程序(25 μL)為：90 ℃，4 min；94 ℃，45 s；61 ℃，45 s；72 ℃，1 min；30個循環，72 ℃延伸10 min。獲得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[10]。利用切膠回收試劑盒對目的基因進行純化，純化后的nirS基因與pMD 19-T Vector載體過夜連接，后轉化到大腸桿菌DH5а感受態細胞中。將轉化菌涂布到含有50 mg/mL Amp、24 mg/mL IPTG和20 mg/mL X-gel的LB平板上[11]進行篩選，挑取陽性克隆子進行擴大培養。利用質粒提取試劑盒提取重組質粒，并用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切消化鑒定，目的基因純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，所得結果通過NCBI網站的Blast進行序列比對，構建成功的質粒命名為pMD 19-T-nirS。

1.2.2 表達質粒pET-32a(+)-nirS的構建

將克隆所得質粒和質粒pET-32a(+)分別用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切消化：ddH2O 6 μL，質粒10 μL，緩沖液2 μL，限制酶Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ各1 μL，為20 μL體系，37 ℃酶切6 h，切膠回收純化，用T4 DNA連接酶將酶切后的兩組分連接過夜，得到重組質粒轉化到大腸桿菌DH5а感受態細胞中，然后涂布到含有50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取陽性菌株進行擴大培養，提取質粒后用T7、T7t引物進行質粒PCR鑒定和凝膠電泳鑒定，所得PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，構建成功的重組質粒命名為pET-32a(+)-nirS。

1.2.3 重組質粒在大腸桿菌中的表達

將提取的質粒pET-32a(+)-nirS轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，取100 μL轉化后的表達菌株涂布到含50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取陽性菌株進行PCR鑒定；將含質粒pET-32a(+)-nirS的菌株以1∶100接種到含有50 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃培養至OD600為0.6(大約5 h)，加入誘導劑IPTG使其最終濃度為1 mmol/L，37 ℃中繼續培養4 h誘導表達，以未誘導表達培養的菌株為陰性對照。分別取菌液20 mL，于4 ℃，4000 r/min離心10 min收集菌體，用預冷PBS(pH 7.4)沖洗2遍后重懸，超聲裂解5 min，每次2 s，間隔5 s，功率500 W，于4 ℃，12000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE電泳檢測表達情況。

1.2.4 重組酶的復性

由實驗1.2.3的結果可知，目的蛋白以包涵體的形態表達[12]，因此需要對包涵體進行復性，才可檢測其酶活。誘導表達后的重組細菌超聲裂解后離心，所得沉淀用預冷的緩沖液(2 mol/L尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、0.6% Triton-100)低溫洗滌2遍，離心后沉淀用裂解液(8 mol/L 尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、pH 8.0)重懸，25 ℃中孵育6 h溶解包涵體，離心后對上清液進行尿素梯度透析復性：依次將包涵體放在尿素濃度為4 mol/L、2 mol/L和PBS緩沖液(均含1 mmol/L EDTA)中透析8 h[13-15]，最后得到復性后的目的蛋白。

1.2.5 重組酶的酶活測定

酶活測定所需反應液的配制：0.1 mol/L Na2HPO4、0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)、0.1 mol/L NaCl、0.01 mol/L Na2S2O4，0.01 mol/L甲基紫精(MV)；重組酶酶活測定按照體系：80 μL反應液、20 μL亞硝酸鈉(100 mg/L)、100 μL適當濃度酶液加入到1.5 mL EP管中，于37 ℃反應15 min，劇烈震蕩結束反應；沸水浴反應3～5 min后低速離心5 min，取100 μL上清液于5 mL比色管中采用格里斯試劑比色法測定亞硝酸鹽濃度[16]，酶活力計算公式如下：

式中：Y為酶活力(U/mg，U表示降解1 ng亞硝酸鹽所需要的時間)；X為降解亞硝酸鹽的量(ng)；t為酶催化時間(min)；M為參加反應的酶液濃度(mg/mL)。

2 結果

2.1 nirS基因的擴增

以植物乳桿菌基因組DNA為模版，經PCR技術擴增得到nirS基因，再由1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1。在1000～2000 bp之間有明顯單一條帶，與預期的1500 bp左右目的片段相符[17，18]，PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序后，經NCBI比對確認為植物乳桿菌的亞硝酸鹽還原酶基因，大小為1638 bp。

圖1 nirS基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of nirS gene

注：M為10000 bp Marker；1為nirS基因PCR擴增產物。

2.2 T克隆載體的鑒定

將轉化了pMD 19-T-nirS質粒的陽性菌株擴大培養，提取質粒后進行雙酶切消化鑒定，所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。酶切消化后的pMD 19-T-nirS質粒分成2個條帶，1000～2000 bp的條帶為nirS基因，而另一條帶為pMD 19-T Vector質粒條帶，與預期結果相符，pMD 19-T-nirS克隆質粒構建成功。

圖2 T克隆載體雙酶切鑒定Fig.2 Identification of T cloning vector by double enzyme digestion

注：M為10000 bp Marker；1為pMD 19-T-nirS質粒雙酶切產物。

2.3 重組質粒pET-32a(+)-nirS的鑒定

篩選所得陽性菌株重新提取質粒，用T7、T7t啟動子引物進行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3。其中可見只有1條條帶在2000 bp左右處，符合預期結果，經測序,所得結果經過NCBI中的Blast進行序列比對后確定含有nirS基因，所以重組質粒pET-32a(+)-nirS構建成功。

圖3 重組質粒pET-32a(+)-nirS的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-nirS by PCR

注：M為10000 bp Marker；1為T7啟動子引物PCR結果。

2.4 重組酶的SDS-PAGE電泳檢測及酶活測定

圖4 重組菌株表達蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.4 Identification of recombinant strain expressed protein by SDS-PAGE

注：M為100 kDa Marker；1為上清液蛋白質鑒定；2為沉淀蛋白質鑒定。

重組菌株經過誘導表達后，對菌液進行超聲波裂解，離心所得上清液及沉淀經過SDS-PAGE電泳檢測結果見圖4，上清液并沒有明顯的蛋白質條帶，而沉淀物在75～100 kDa之間有一條明顯條帶，與預期條帶大小相符，故nirS基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達形成包涵體。通過低濃度尿素梯度稀釋法對包涵體進行復性后，獲得12.37 mg具有酶活力的重組蛋白，并測得其酶活力為2131.5 U/mg。

3 結論

亞硝酸鹽還原酶大多為胞內酶，現已在高等植物、藻類植物和各種微生物中發現其存在。植物細胞中，nirS主要存在于葉綠體和非綠色組織中的質體中[19]；微生物中，nirS常見于反硝化細菌中，如：Pseudomonasaeruginosa[20]，AlcaligenesfaecalisS-6等，但這些菌株均可能存在食品安全隱患，來自食用泡菜中篩選得到的乳酸菌基因組DNA，可在菌株來源上具有相對安全保障[21]。

有關研究表明，利用亞硝酸鹽還原酶來降解亞硝酸鹽，方法之一是直接將產亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌加入到發酵產品之中。Peiman Esmaeilzadeh等在發酵香腸時分別加入Lactobacillusplantarum，Lactobacillusfermentum和兩種菌混合制成的發酵劑[22]，發現在發酵4 d后，接種了菌株的香腸中亞硝酸鹽含量明顯比自然發酵的低中，但是，接種了菌株的香腸中，乳酸含量更高且pH值更低，改變了已有的食品品質。此外，有人提出從發酵乳酸菌中分離提純出亞硝酸鹽還原酶后以酶制劑的形式使用。陳浩等將干酪乳桿菌分次誘導發酵2次后，經過溶菌酶和超聲波破碎后分離提純該酶，從1 L發酵液中純化得到了0.54 mg活性蛋白，比活力為1851.2 U/mg[23]。這種方法的缺點是步驟冗長，獲得的產量較低。本研究從泡菜中篩選得到高效降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌，利用基因工程技術將植物乳桿菌中的nirS基因轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，獲得以包涵體形式存在的nirS后，利用低濃度尿素梯度稀釋法進行復性，最后從200 mL發酵液中得到有活性的粗酶液12.37 mg，比活力為2131.5 U/mg。這種方法具有原料消耗低、快捷、高效以及不會改變產品風味等優點。但是，由于亞硝酸鹽還原酶異源表達后以包涵體形式存在，而包涵體的復性率都較低，所以今后的研究需要針對亞硝酸鹽還原酶包涵體的復性程序進行進一步的優化。