燈冰注射液對家兔血小板聚集功能的影響

　　摘要：目的：研究燈冰注射液對血小板聚集率的影響。方法：家兔耳緣靜脈注射燈冰注射液及體外給藥，用比濁法檢測家兔血小板在不同的誘導劑作用下的聚集率。結果：燈冰注射液注射給藥能降低二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)誘導的血小板聚集率；體外給藥能降低ADP誘導的血小板聚集率。結論：燈冰注射液具有抑制血小板聚集的作用。
　　關鍵詞：燈冰注射液；血小板聚集；二磷酸腺苷；血小板活化因子；花生四烯酸
　　中圖分類號：R285.5
　　文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349(2008)02-0036-03
　　
　　燈冰注射液(DBI)由燈盞花素與冰片組成的新的中藥復方制劑，具有開竅、活血祛瘀、止痛的作用，用于心肌缺血、中風及其后遺癥等疾病的治療。上述疾病中，血小板的過度活化是其重要的因素之一，表現為血小板聚集、粘附率及血小板內活性物質釋放增加。本試驗觀察了DBI對血小板聚集功能的影響。
　　
　　1、材料與方法
　　
　　1、1藥物
　　燈冰注射液，100ml.瓶^-1，批號20060405，由南京中醫藥大學中醫藥研究院植物藥中心提供；陽性對照藥：阿斯匹林，25mg，片^-1，批號040506，南京恒生制藥廠生產。
　　
　　1、2動物
　　大耳白家兔，體重2.0～2.5kg，雄性，由南京江寧縣湯山青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產許可證：SCXK(蘇)2002-0027，實驗動物使用許可證：SYXK(蘇)2005-0009。
　　
　　1、3試劑
　　血小板活化因子(PAF)：規格1mg/支，批號74389-68-7，由sigma公司生產；二磷酸腺苷(ADP)：規格0.5g，瓶^-1，批號：990527，上海伯奧生物科技有限公司；花生四烯酸(AA)：規格100mg，瓶^-1，批號：044K1372，由sigma公司生產；檸檬酸三鈉：規格500g.瓶^-1，批號030413，AR，上海凌峰化學試劑有限公司、常熟市永華精細化學品有限公司生產。
　　
　　1、4儀器
　　PAPER-I型血小板聚集及血凝測定儀，北京世帝科學儀器公司生產；LDZ5-2離心機，北京醫用離心機廠生產。
　　
　　1、5方法
　　1、5、1家兔在體血小板聚集實驗家兔30只，隨機分為5組：正常對照組(耳緣靜脈注射等容積生理鹽水)；陽性對照組阿斯匹林(3.5mg.kg^-1)灌胃給藥；DBI高劑量(4mg.kg^-1)、中劑量(2mg.kg^-1)、低劑量(1mg.kg^-1)耳緣靜脈注射給藥。每日1次，連續3d。血小板聚集率檢測：參照文獻方法，于第3d給藥后20min(陽性對照組于給藥后60min)頸動脈取血，枸櫞酸鈉(3.8％)1：9抗凝，以1000r.min^-1離心10r.min^-1，取富血小板血漿(PRP)，剩余部分以3000r.min^-1離心，取貧血小板血漿(PPP)，聚集誘導劑用PAF(終濃度0.38μg/ml^-1)、ADP(終濃度5.54μg.ml^-1)、AA(終濃度76.90μg.ml^-1)。用PAPER-I型血小板聚集及血凝測定儀測定血小板1min、5min、max聚集率，并按下述公式計算抑制率。血小板聚集抑制率(％)=(對照組血小板聚集率－給藥組血小板聚集率)／對照組血小板聚集率×100
　　1、5、2家兔體外血小板聚集率測定方法　 大耳白家兔，雄性，用利多卡因局部麻醉，頸動脈插管放血，3.8％的枸櫞酸鈉1：9抗凝，以1000r.min^-1離心10min，取富血小板血漿(PRP)，剩余部分以3000r.min^-1離心，取貧血小板血漿(PPP)，聚集誘導劑用ADP(終濃度5.54μg.ml^-1)。每管250μl PRP中加入不同濃度的藥物10μl，對照組PRP中加入生理鹽水10ul，37℃溫育5min，然后加入5.54μg，ml^-1的ADP10μl，檢測血小板聚集率，并計算藥物的半數抑制濃度(IC)。
　　
　　1、6統計學方法
　　實驗數據以x±s表示；使用SPSS11.5統計軟件，進行方差分析(q檢驗)。
　　
　　2、結果
　　
　　2、1 DBI對AA誘導的家兔在體血小板聚集率的影響　 與空白對照組比較，DBI耳緣靜脈給藥高、中、低3個劑量均能顯著抑制AA誘導的家兔血小板的最大聚集率，對1min、5min的聚集率也有不同程度的抑制作用；但較陽性藥阿司匹林組弱，見表1。
　　
　　
　　2、2 DBI對ADP誘導的家兔在體血小板聚集率的影響　 與空白對照組比較，DBI靜脈給藥高、中、低3個劑量均能明顯抑制ADP誘導的家兔血小板的1min及最大聚集率，高、中劑量對5min聚集率有顯著的抑制作用；與陽性藥阿司匹林組比較，高、中、低3個劑量對1min時的血小板聚集率無顯著性差異，高劑量組的最大聚集率也無顯著性差異，見表2。
　　
　　
　　2、3 DBI對PAF誘導的家兔在體血小板聚集率的影響　 與空白組比較，DBI靜脈給藥高、中、低3個劑量均能明顯抑制PAF誘導的家兔血小板的1min、5min及最大聚集率；與阿司匹林組比較，DBI高劑量組對1min、5min及最大聚集率與阿司匹林組均無顯著的差異，見表3。
　　
　　
　　2、4 DBI對ADP誘導的家兔體外血小板聚集率的影響　 體外給藥DBI終濃度為296.3μg.ml^-1、148.15μg.ml^-1、74.07μg.ml^-1對家兔血小板的最大聚集率均有明顯的抑制作用。且作用與劑量間呈依賴關系：y=-0.0373x+45.516；r=0.9699，見表4、圖1。
　　
　　
　　3、討論
　　
　　血小板是一種多功能細胞，具有粘附、聚集和釋放功能，在血栓形成與止血過程中起著重要作用。心肌缺血、腦梗塞等心腦血管疾病均具有血小板聚集釋放功能亢進、血小板聚集率增高等現象。本試驗結果表明：DBI注射給藥對ADP、PAF、AA誘導血小板聚集均具有不同程度的抑制作用，體外也有抑制ADP誘導的血小板聚集作用，這可能是其治療心肌缺血、腦梗塞及其后遺癥等心腦血管疾病的作用途徑之一。
　　ADP、AA、PAF是體內的活性物質。血小板聚集主要存在ADP、血栓素A(TXA)與血小板激活因子(PAF)三條途徑。ADP通過和血小板膜表面上的特異性受體的結合，增加三磷酸肌醇(IP)量，動員胞內貯存的鈣離子(Ca²⁺)釋放到細胞質中，使胞內Ca²⁺濃度升高，而使血小板活化，引起血小板粘附、聚集。在組織缺血時，受損組織釋放出AA，通過環氧化酶途徑轉變為前列腺素環內過氧化物(PGG，PGH)，進而增加血栓素A(TXA)的生成。在腦梗塞、心肌梗死患者中，PAF的產生是明顯增加的。在上述血小板活化途徑中，ADP促進TXA生成，而TXA與PAF可進一步促進ADP釋放，因此ADP途徑居于重要地位。本實驗觀察到DBI對ADP誘導的血小板聚集抑制作用比AA、PAF誘導的血小板聚集抑制作用強，且對ADP誘導體外血小板聚集亦有抑制作用，并具有明顯的量效關系，提示DBI抑制血小板聚集作用可能主要通過ADP途徑，但究竟是影響血小板膜上ADP受體，還是影響血小板內顆粒成分的釋放，尚待進一步研