ＨＰＬＣ法檢測闌尾靈顆粒芍藥苷含量的方法的建立

摘要：目的：建立HPLC法測定闌尾靈顆粒中的芍藥苷含量；方法：采用C18柱，以甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）為流動相，檢測波長為230nm。結果：該方法簡便，準確，專屬性強，重現(xiàn)性好。平均加樣回收率為100.92%，RSD為1.27%。結論：該方法可做為闌尾靈顆粒質量控制指標。

關鍵詞：HPLC;闌尾靈顆粒;芍藥苷

闌尾靈顆粒收載于中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標準》中藥成方制劑第二十冊[1]。具有清熱解毒，瀉下通便，破閼散結，理氣止痛的功效。用于急性單純性闌尾炎(瘀滯型)；急性化膿性闌尾炎早期(蘊熱型)。臨床療效明顯，深受患者喜愛。為保證其質量的可控性，經研究建立了用高效科學液相法測定闌尾靈顆粒中芍藥苷的含量測定方法。

1儀器、試藥及試劑

1.1 儀器：Waters高效液相色譜儀；N2000色譜工作站（浙江大學）；Waters 746型積分儀; Waters 486檢測器。島津UV2401PC 可見紫外分光光度計；賽多利斯Bp211D分析天平；KQ600B型超聲波振蕩儀（江蘇昆山）。色譜柱：Hypersil BDS C18 （5μm.. 4.6mm×250mm）。

1.2 試藥：芍藥苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號：0736－200014），甲醇：色譜純（Fisher公司）； 磷酸：分析純（天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心） ；水：超純水。闌尾靈顆粒 (哈藥集團中藥二廠)（批號：20010101，20010102，20010103）

1.3．提取方法確定

提取溶媒的選擇。在供試品溶液制備中，分別選用了95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇進行超聲提取，結果表明：70%甲醇分離效果、峰形及含量均為最好，所以選擇70%甲醇進行超聲提取。

提取時間的選擇。取供試品適量，用70％甲醇溶解，超聲波振蕩分別提取20、25、30分鐘，制備供試品溶液，結果表明：三種提取時間結果無明顯差異，為保證提取完全，采用超聲提取30分鐘。

檢測條件的選擇

波長選擇：取芍藥苷對照品適量，加70%甲醇溶解，用PERKINELMEBDA 3B紫外檢測分光光度儀進行全波長掃描，在230 nm處有最大吸收，故其最大吸收峰位于230nm處，與《中國藥典》2005年版一部[2]赤芍藥材項下的含量測定標準一致，因此將檢測波長定為230nm。

流動相的選擇：先后試用甲醇-水（30：70）、甲醇-水-磷酸（20：80：0.07）、甲醇-水-磷酸（25：75：0.1）及甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）四種比例的流動相。只有流動相為甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）時，成品中芍藥苷與其它組分均能達到基線分離。

檢測條件：根據(jù)上述考查的結果，確定流動相為甲醇-水-磷酸（27：73：0.1），檢測波長為230nm，流速為1.0ml/min。

1.4 陰性干擾試驗：在處方中去除赤芍、牡丹皮藥材，按方中比例和制備工藝方法制成陰性制劑，用供試品溶液制備的方法，制成陰性對照溶液，用以上選定的測定條件進行吸收曲線繪制，觀察在與芍藥苷相同的保留時間處是否存在吸收峰，結果表明：在選定條件下測得的陰性液吸收曲線在與芍藥苷相同保留時間處不存在吸收峰，因此說明選定的條件測定芍藥苷無干擾，具有較強的專屬性。

2. 方法與結果

2.1線性考察試驗 精密稱取芍藥苷對照品18.85mg，置50ml量瓶中，用70％甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。進樣量分別為2、5、8、11、14、17μl，按含量測定方法測定峰面積，并以峰面積的積分值為橫坐標，對照品進樣量為縱坐標建立標準曲線，計算回歸方程?；貧w方程為：y=1915305.357X＋8373.404372（r=0.999 4），芍藥苷在0.149μg～1.2665μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2 精密度試驗精密稱取芍藥苷18.85mg，置50ml量瓶中，加70%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇溶解，并稀釋至刻度，連續(xù)6次等量注入同臺液相色譜儀中進行測定，考察其精密度，結果見表1：

由表1可見，此含量測定方法的精密度良好。

2.3 重現(xiàn)性試驗分別稱取同批闌尾靈顆粒樣品6份，按質量標準含量測定項下方法測定含量，并計算樣品的RSD值，結果見表2:

由表2可見，此含量測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗取同一供試品，按正文含量測定方法測定后，樣品置室溫下放置，每間隔2小時測定1次，連續(xù)測4次，測定結果的RSD=2.16%。證明供試品制備后10小時內測定結果穩(wěn)定。測試結果見表3。

由表3可見，此含量測定方法的穩(wěn)定性良好。

2.5加樣回收試驗

對照品溶液配制：取芍藥苷18.85mg，70％甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，即得。本對照品溶液濃度為0.377mg/ml。

精密稱取已知含量（含量為7.1832mg／g）的樣品6份，每份約0.15g，分別加入芍藥苷對照品溶液3ml（相當于對照品1.131mg），按質量標準含量測定項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并測定含量，計算回收率。結果見表4：

結果表4表明，本檢測方法具有較好的回收率。

2.6含量限度的確定按本品質量標準含量測定項下方法，測定了十批樣品，結果見表5：

結果表明，樣品中芍藥苷的含量差異，每克樣品含赤芍、牡丹皮以芍藥苷計均大于4.2mg，且3批樣品含量的平均值為5.2，5.2×80%=4.16，因此規(guī)定闌尾靈顆粒中含赤芍、牡丹皮以芍藥苷計均大于4.0mg。即每袋芍藥苷含量不低于45mg。

結果 該方法測定芍藥苷含量重現(xiàn)性好，靈敏度高，可以作為闌尾靈顆粒質量控制。

參考文獻

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部，藥品標準，中藥成方制劑，第二十冊。

[2] 中國藥典[S]，2005年版，一部。