補充賴氨酸對大鼠心、肝組織Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２的影響

摘要：為了解補充不同濃度賴氨酸對力竭運動大鼠心、肝組織細胞凋亡的影響，觀察其對心、肝組織細胞凋亡調控基因Bax和Bcl-2的變化，探討賴氨酸對力竭運動大鼠機體的保護作用。將32只大鼠進行3 d的跑臺運動適應性訓練后，隨機分成4組：安靜對照組、運動組、低濃度給藥組和高濃度給藥組。力竭運動大鼠均采用Bedford所建立的運動負荷模型。實驗結束用免疫組織化學法檢測心、肝組織細胞凋亡調控基因Bax和Bcl-2的陽性物質平均光密度值、面積和含量。結果：與對照組比較，運動組和給藥組心、肝組織細胞凋亡調控基因Bax光密度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，與運動組比較，差異也具有顯著性(P﹤0.05)，不同濃度賴氨酸的作用相當，差異沒有顯著性；運動組與對照組比較，心、肝組織細胞凋亡調控基因Bcl-2光密度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，給藥組與運動組比較，心組織細胞凋亡調控基因Bcl-2光密度值差異也具有顯著性意義(P﹤0.05)，只肝細胞表現高濃度給藥組比低濃度給藥組相比差異有顯著性。結果說明：大強度急性力竭運動可使大鼠心、肝組織致損傷，誘導肝細胞凋亡，L-賴氨酸對急性力竭運動的大鼠心、肝組織有保護作用。

關鍵詞：大強度急性力竭運動；L-賴氨酸；細胞凋亡調控基因；免疫組織化學

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-7116(2008)05-0094-05

Effects of lysine supplement on Bax and Bcl-2 of cardiac and hepatic tissue of rats

LUO Rong-bao1，ZHANG Gui-lan2，LIU Wen-feng3，LIU Hui-min3

（1.Department of Physical Education，Xiangnan College，Chenzhou 423000，China；2.Department of

Physical Education，Changsha Institute of Vocational and Technical Aviation，Changsha 400124，China；

3.School of Physical Education，Hunan Normal University，Changsha 410012，China）

Abstract: In order to gain an insight into the effects of lysine with different concentrations on the apoptosis of cardiac and hepatic histiocytes of rats doing an exhaustive exercise， to observe the change which lysine causes to Bax and Bcl-2 (genes that regulate the apoptosis of cardiac and hepatic histiocytes)， and to probe into the function of lysine in protecting the body of rats doing an exhaustive exercise， the authors divided 32 rats randomly into 4 groups (calm control group， exercise group， low concentration lysine supplied group and high concentration lysine supplied group) for 3 days of adaptation training on a running track， adopted the exercise load model established by Bedford for rats doing an exhaustive exercise， used an immunohistochemical method to test the average optical density， area and content of the positive substance of Bax and Bcl-2 when the experiment was finished， and revealed the following findings: there is a significant difference (P<0.05) in optical density of Bax between the exercise group/lysine supplied groups and the control group， and also between the lysine supplied groups and the exercise group; no significant difference was produced by the function of lysine with different concentrations， whose function is pretty much the same; there is a significant difference (P<0.05) in optical density of Bcl-2 between the exercise group and the control group， and also between the lysine supplied groups and the exercise group， and there is a significant difference in hepatic cell expression between the high concentration lysine supplied group and the low concentration lysine supplied group. From the said findings the authors drew the following conclusions: a high intensity acute exhaustive exercise can cause the damage of cardiac and hepatic tissue of rats， and induce the apoptosis of hepatic cells; L-lysine has the function of protecting cardiac and hepatic tissue of rats doing an exhaustive exercise.

Key words: high intensity acute exhaustive exercise；L-lysine；cell apoptosis regulating gene；immunohistochemistry

細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性死亡(programmed cell death，PCD)。它是細胞在一定的刺激或病理條件下，遵循自身的程序，有序地走向消亡的過程。當組織細胞凋亡異常（過高或過低）時，可導致各種疾病的發生。肝細胞凋亡的異常在急、慢性肝損傷的發病機制中起著重要作用[1]。在大強度運動過程中，由于能源物質耗竭，代謝產物堆積及氧化應激所造成的自由基損傷等多種因素的影響，機體運動能力下降，出現運動性疲勞，還引起肝細胞凋亡。如何克服運動過程中機能水平下降過快以及加快運動后運動性疲勞的消除一直是運動醫學界研究的熱點問題之一。資料顯示人們對賴氨酸(Lysine)與力竭運動之間關系的研究比較少，課題組成員劉慧敏等[2]已報道劇烈運動前后適時適量飲用賴氨酸能抵抗氧化應激代謝產物的生物毒性作用，保護機體免受傷害。本研究通過運動前補充賴氨酸對大強度急性力竭運動大鼠的心、肝組織細胞凋亡調控基因Bax（Bcl-2 associsted x）、Bcl-2(B-cell lymphoma/lenkmia-2)的影響的實驗，探討L-賴氨酸對力竭運動后大鼠的保護作用，為科學選用氨基酸作為運動強力手段的機制研究，提供一定的實驗證據。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康雄性10周齡(Sprague-Dawley)大鼠32只，體重(219.87±13.49) g(購自湖南農業大學動物中心，許可證號：湘scxk2003-003)，為清潔級實驗動物。所有動物按國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養，每籠6只，自由飲食飲水。室溫控制在(22±2)℃，相對濕度45%~55%，自然光照。保證實驗室隔天用消毒液消毒。

進行3 d的跑臺運動適應性訓練(速度為10 m/min，時間為10 min/d，坡度為0°)，隨機分成4組。分組情況見表1。

1.2動物模型

1)力竭運動模型[3]。

安靜組大鼠不運動，運動實驗組大鼠休息2 d。正式實驗時，運動強度依Bedford所建立的運動負荷模型，跑臺坡度為10°，大強度力竭運動組為26.8 m/min(相當于92.3% Vo2max)的速度運動至力竭。運動時使用聲音刺激及小木棍刺激動物尾部，必要時采用一定電刺激，使動物保持在跑道前1/3處，以保證運動強度。

2)力竭標準。

運動后期，大鼠跑的動作較運動前期明顯吃力，動物未能堅持原跑速，跑的姿勢由開始時的蹬地跑變為半臥位跑，腹部與跑道時有接觸，甚至為臥位跑，到運動末期，大鼠先后滯留跑道后1/3處達3次以上，各種刺激驅趕均無效，停跑后體征表現為呼吸急促、神情倦怠、腹臥位、對刺激反應遲鈍，捕捉時，逃避反應較運動前減弱[4]。

1.3實驗儀器與試劑

1)儀器。

SHH#8226;W21#8226;600三用電熱恒溫水箱(天津市萊斯特儀器有限公司)、UV-9200紫外可見光光度計(北京瑞利分析儀器公司)、TGL-16C臺式高速離心機(湖南星科科學儀器設備有限公司)、PT動物電動跑臺(浙江杭州立泰科技有限公司)、820輪轉組織切片機(美國AO公司)等；鼠源Bax和Bcl-2一抗和鼠二抗(北京中杉金橋生物工程有限公司)；OLYMPUS BX52顯微照相圖像采集系統(日本奧林巴斯株式會社)。

2)試劑的配制。

(1)磷酸緩沖液(PBS)：取0.2 mol/L Na2HPO4#8226;12H2O和0.2 mol/L NaH2PO4#8226;2H2O配制pH=7.4、7.2、7.0、6.8的PBS緩沖液。

(2)鹽酸賴氨酸：稱取L－賴氨酸(相對分子質量182.66，質量分數99％)3.690 1 g，于8 mL超純水中溶解，定容至10 mL；配制0.1 mol/L和0.2 mol/L兩種濃度賴氨酸。

1.4取材與指標檢測

1)取材。

大鼠處死后，將大鼠呈仰臥位于手術臺上，暴露胸腔。迅速取肝左側葉，按照長、寬、高為5、3、5 mm的標準取樣，置于質量分數為4%的多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.4）中固定24 h后進行常規石蠟包埋，每個蠟塊每隔20 μm連續切片5張，每張厚5 μm，用于免疫組化等標本制作。

2)免疫組織化學測試。

新鮮組織按照長、寬、高為5、3、5 mm的標準取樣，置于質量分數為4%的多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）中固定24 h后進行常規石蠟包埋，旋轉切片機連續切片，每張厚5 μm，烘烤后置于4℃冰箱保存待測。石蠟切片脫蠟至蒸餾水：用質量分數為3%的H2O2室溫孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶；用0.01 mol/L pH6.0的檸檬酸（又叫枸櫞酸）緩沖液，置WD900 AS25 R-2型號Galanz（格蘭士）微波修復抗原，PBS液沖洗5 min×3；自然冷卻，用5%~10%山羊血清，室溫孵育10 min，減少或消除非特異性染色；分別滴加一抗(1︰50)(鼠源Bax和Bcl-2多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，置4℃冰箱過夜；取出，室溫孵育15 min(最好片子溫至室溫程度，若片子出現干的情況馬上用PBS洗濕)，PBS液沖洗5 min×3；滴加二抗（PV6001/6002二步法免疫組化檢測試劑，購自北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃恒溫箱中孵育30 min（烤片）；PBS液沖洗5 min×3，用終質量分數為0.05% DAB- 0.03% H2O2顯色4~5 min；PBS液充分沖洗，蘇木素常規染色4~5 min，質量分數為1%的鹽酸酒精分色數秒；烘干，中性樹膠封片。

用PBS代替一抗作為空白對照。

3)免疫組織化學顯微圖象分析。

計算機顯微圖象分析系統為美國COMPIX Simple PCI生物顯微分析圖像系統。每組選片10張，每張切片鏡下（×400）隨機取5個視野進行分析，陽性物質用灰度值和陽性表達面積表示。

1.5統計學處理

所有實驗數據均應用SPSS11.0統計軟件包進行分析，用平均數±標準差( ±s)表示，經方差分析進行組間差異比較，α=0.05提示差異有顯著性意義。

2結果與分析

2.1補充不同濃度賴氨酸對急性力竭運動大鼠心、肝組織細胞凋亡調控基因Bax的影響

結果(表2)顯示，與對照組比較，運動組和給藥組心組織細胞凋亡調控基因Bax平均光密度值差異具有顯著性意義（P<0.05），運動組的陽性物質表達面積和Bax含量差異具有非常顯著性意義(P﹤0.01)，給藥組的差異卻只具有顯著性(P﹤0.05）；與運動組相比較，給藥組心組織細胞凋亡調控基因Bax的陽性物質表達面積和含量差異具有非常顯著性意義(P﹤0.01)；高濃度給藥組的Bax平均光密度值比低濃度組低，但差異沒有顯著性。

與對照組比較，運動組的肝組織細胞凋亡調控基因Bax灰度值差異具有非常顯著性意義(P﹤0.01)，給藥組的差異卻只具有顯著性(P﹤0.05)，運動組和給藥組的陽性物質表達面積和Bax含量差異具有顯著性意義(P﹤0.05)；與運動組相比，給藥組的Bax灰度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)；高濃度給藥組的Bax平均光密度值比低濃度組低，但差異沒有顯著性。

2.2補充不同濃度賴氨酸對急性力竭運動大鼠心、肝組織細胞凋亡調控基因Bcl-2的影響

結果(表3)顯示，與對照組比較，運動組的心組織細胞凋亡調控基因Bcl-2平均光密度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，而給藥組的差異具有非常顯著性(P﹤0.01)，運動組和給藥組的陽性物質表達面積和Bcl-2含量差異具有顯著性意義(P﹤0.05)；與運動組比較，給藥組心組織細胞凋亡調控基因Bcl-2平均光密度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)；高濃度給藥組的Bcl-2高于低濃度給藥組，但差異沒有顯著性。心肌組織的對照組、運動組和給藥組的Bax/Bcl-2分別為0.82、0.99、0.87和0.84。

與對照組比較，運動組的肝組織細胞凋亡調控基因Bcl-2平均光密度值、陽性物質表達面積和含量差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，給藥組的卻具有非常顯著性差異(P﹤0.01)；與運動組比較，給藥組的Bcl-2平均光密度值、陽性物質表達面積和含量差異具有顯著性意義(P﹤0.05)；與低濃度給藥組相比，高濃度給藥組的Bcl-2更強，差異具有顯著性意義(P﹤0.05)。肝組織的對照組、運動組和給藥組的Bax/ Bcl-2分別為0.93、1.03、0.88和0.76。

3討論

3.1補充賴氨酸對心組織細胞Bax和Bcl-2的影響

大量的臨床證明，賴氨酸可提高血中SOD和CAT活性，降低血中氧自由基含量[5]，使大腦細胞和肌肉組織維持正常的生理功能，同時為組織損傷的修復提供了必需的氨基酸和能量來源，這對提高運動能力十分有益。宋東林等[6]報道賴氨酸治療癲癇臨床效果顯著，患者血中SOD和CAT活性顯著升高。由于賴氨酸能清除自由基，因此可延緩運動疲勞的發生和加快運動疲勞的恢復，這對提高運動能力具有重要意義[7-8]。

本實驗結果表明，與對照組比較，運動組和給藥組心組織細胞凋亡調控基因Bax灰度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，說明大強度急性力竭運動對心臟有損傷作用，Bax的高表達，可能就是對大鼠機體的應激太大導致促凋亡基因表達而誘導心肌細胞凋亡來保護機體，但是凋亡過多對機體是有害的，這基本已經被大家公認。給藥組與運動組相比較，差異也有具有顯著性(P﹤0.05)；高濃度給藥組的Bax平均光密度值比低濃度組低，但沒有差異顯著性，說明運動前補充賴氨酸對機體具有保護作用，補充不同濃度賴氨酸作用相當，具體機制有待進一步研究。

關于Bcl-2，本實驗結果顯示，與對照組相比較，運動組的心組織細胞凋亡調控基因Bcl-2灰度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，與運動組比較，給藥組心組織細胞凋亡調控基因Bcl-2灰度值差異也具有顯著性意義(P﹤0.05)。Bcl-2和Bax是與細胞凋亡有密切關系的基因，Bcl-2和Bax兩蛋白之間的比例關系影響細胞凋亡的狀態。Bcl-2水平高于Bax時，Bcl-2和Bcl-2形成同源二聚體，細胞凋亡受抑制，凋亡過程減慢，凋亡細胞減少；Bax表達高于Bcl-2時，則形成Bax和Bax同源二聚體，細胞凋亡增強，Bcl-2和Bax水平相當時，形成Bcl-2-Bax二聚體，細胞凋亡終止。并且，Bcl-2和Bax定位于線粒體膜上，這為其調控細胞凋亡提供了條件[9]。從本實驗結果來看充分說明大強度急性力竭運動在促進Bax高表達時，抑凋亡基因Bcl-2表達也有所增加，Bcl-2和Bax兩蛋白之間的比例是導致細胞凋亡發生增加，但是運動前補充賴氨酸能促進Bcl-2高表達，使Bcl-2和Bax兩蛋白之間的比例得到調整而相對減少凋亡的發生，說明賴氨酸對機體保護作用，可能是調節Bcl-2和Bax兩蛋白的比例從而減少凋亡是其機制之一，值得進一步研究。金其貫等[10]的研究表明，運動是引起心肌細胞凋亡的重要因素。大鼠不運動組的心肌組織未見凋亡細胞，每天1 h運動組12.5%的心肌組織出現凋亡細胞，過度運動組66.7%的大鼠心肌組織出現細胞凋亡。對照組、1 h運動組和過度運動組Bcl-2均表達，而過度運動組Bcl-2的表達顯著低于1 h運動組，幾乎與對照組相等。Bcl-2的低表達和細胞凋亡的高出現，提示長期不運動和長期過度運動，對心臟的影響都是負面的。而長期過度運動，心肌組織細胞凋亡增加，可能是早期運動性心肌損傷的機制之一。

3.2補充賴氨酸對肝組織Bax和Bcl-2的影響

有研究表明在運動時，機體會發生血液重新分配現象，使運動骨骼肌的血管舒張，血流量增加，而腹腔內的臟器和皮膚的血管收縮，血流量減少，肝臟作為內臟器官之一，亦是血液重新分配對象之一，運動時供應肝臟的血液明顯減少，又由于肝臟的高代謝特點，肝臟是人體最易受缺血影響的臟器之一[11]。本實驗結果表明，與對照組比較，運動組和給藥組肝組織細胞凋亡調控基因Bax灰度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)，說明大強度急性力竭運動對肝有損傷作用。與運動組比較，給藥組的差異也有具有顯著性(P﹤0.05)。唐瑤函[12]采用運動組24只大鼠依據Bedford建立的大鼠運動模型方案進行運動：跑臺坡度為10°，速度為19.3 m#8226;min-1（相當于76%Vo2max）。中等強度運動20 min、1 h對大鼠肝細胞凋亡未見明顯影響；中等強度運動2 h可致大鼠肝細胞凋亡，運動至力竭時大鼠肝細胞凋亡更為明顯；大鼠肝組織糖原含量、NO含量與肝細胞凋亡呈負相關；Bax與Bcl-2基因參與調控肝細胞的凋亡，二者之間的平衡關系可能是維持或導致凋亡是否發生的重要因素。說明運動前補充賴氨酸對機體具有保護作用，具體機制有待進一步研究。

關于Bcl-2，本實驗結果顯示，與對照組比較，運動組的肝組織細胞凋亡調控基因Bcl-2灰度值差異具有顯著性意義(P﹤0.05)。程麗彩等[13]認為一定強度和持續時間的運動訓練能夠引起人體肝細胞凋亡，同時引起機體各組織不同程度的疲勞和損傷?？梢哉f運動引發的肝細胞凋亡是人體細胞“生存競爭”的結果，由運動訓練的外界刺激而產生了機體細胞的“自然選擇”。與運動組比較，給藥組肝組織細胞凋亡調控基因Bcl-2灰度值差異也具有顯著性意義(P﹤0.05)。Bcl-2和Bax是與細胞凋亡有密切關系的基因，具體在前已經論述?？傊?，說明賴氨酸對肝組織起到了保護作用，可能是調節Bcl-2和Bax兩蛋白之間的比例從而減少凋亡是其機制之一，具體值得進一步研究。

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[編輯：鄭植友]