低溫乙醇法在人血白蛋白工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用

摘 要：人血漿中含有數(shù)量眾多的蛋白成分，如何把它們分離開來一直是個比較熱門的課題。二戰(zhàn)時期，哈佛大學(xué)的Cohn教授發(fā)明了低溫乙醇分離法后，血漿蛋白分離工業(yè)才得以蓬勃發(fā)展起來。本文將結(jié)合低溫乙醇法的基本原理以及筆者實際的工作經(jīng)驗和體會，對人血白蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)過程進(jìn)行闡述。

關(guān)鍵詞：低溫乙醇法 人血白蛋白 工業(yè)化生產(chǎn)

人血漿中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白成份約有100多種，其中已經(jīng)分離提純和性質(zhì)明了的有60余種，大約20種已經(jīng)有臨床用途。血漿蛋白的分離，是利用不同蛋白成份的理化性質(zhì)，如分子大小、密度高低、表面結(jié)構(gòu)、荷電狀態(tài)等的區(qū)別，將其互相分開。

血漿蛋白分離工業(yè)在中國起步比較晚，直到上世紀(jì)80年代才真正開始了大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，目前全國有30余家血制品生產(chǎn)企業(yè)，但其中大部分企業(yè)的主要產(chǎn)品僅有人血白蛋白和靜脈注射用人免疫球蛋白這2種血漿中含量最大的成份，可以說對血漿資源的利用率是比較低的。

血漿蛋白分離的方法很多，其中大部分方法只適用于實驗室研究使用，如電泳、等點聚焦等，可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的只有沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑法等）、層析法（凝膠層析、離子交換層析以及親和層析），另外的超濾、吸附、變性處理等均為輔助手段。目前，國內(nèi)用于生產(chǎn)人血白蛋白和免疫球蛋白類制品的生產(chǎn)方法基本都是低溫乙醇法。筆者結(jié)合低溫乙醇法的基本原理以及本人實際的工作經(jīng)驗和體會，對人血白蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)過程進(jìn)行闡述。

人血白蛋白是一個一級結(jié)構(gòu)簡單的單鏈蛋白，無碳水化合物側(cè)鏈，僅含少量的脂肪酸，構(gòu)型較為對稱，分子量約為69000D，由585個氨基酸殘基組成，富含門冬氨酸及谷氨酸，而缺乏色氨酸。天然狀態(tài)下，白蛋白含有19個負(fù)電荷，其i.e.p依溶液中含有的鹽的種類與濃度的不同在pH4.4~5.4之間。

低溫乙醇法的原理和要點為：往蛋白質(zhì)的水溶液中加入乙醇，產(chǎn)生幾種效應(yīng)，主要效應(yīng)是降低水分子的活度，降低溶液的介電常數(shù)，從蛋白分子周圍排代水分子，使蛋白分子和蛋白分子之間通過極性基團(tuán)的相互作用在范德華引力下發(fā)生凝聚，從而沉淀下來。影響這種沉淀過程的主要有5大參數(shù)：溶液的蛋白濃度、pH值、離子強(qiáng)度、溶液的溫度和乙醇的濃度。在前4個參數(shù)都一致的情況下，乙醇的沉淀作用取決于蛋白分子的大小。在逐漸提高乙醇濃度時，蛋白將按分子大小順序先后沉淀。人血白蛋白作為血漿主要成分中分子量最小的一種，是在最后一步的沉淀反應(yīng)中分離出來的。下面是人血白蛋白生產(chǎn)的簡要工藝流程圖。（其中的部分主要參數(shù)進(jìn)行了模糊化處理）

人血白蛋白制備工藝流程

步驟①：原料血漿的檢測。在現(xiàn)今血液傳播疾病越來越令人恐懼的情況下，對血漿進(jìn)行常見的5種病毒檢測是國家的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，而且必須是對每一袋單采血漿進(jìn)行5項病毒檢測，合格后方可投入生產(chǎn)。

步驟②：8%乙醇沉淀反應(yīng)，產(chǎn)生組份I沉淀，主要成分為纖維蛋白原。組份I沉淀可以用于人纖維蛋白粘合劑的生產(chǎn)。在此步驟之前一般會對原料血漿進(jìn)行一次離心，可以分離得到冷沉淀，這也是制造凝血因子VIII的原料。離心去除冷沉淀之后的血漿可以用于人凝血酶原復(fù)合物（凝血因子II、VII、IX、X的混合物）的吸附生產(chǎn)。然后可以進(jìn)行8%乙醇沉淀反應(yīng)（若不生產(chǎn)凝血因子VIII和人凝血酶原復(fù)合物，也可以直接對原料血漿進(jìn)行8%乙醇沉淀反應(yīng)）。由于工業(yè)化生產(chǎn)中投入的血漿數(shù)量巨大（一般一次為5000千克血漿左右），反應(yīng)罐的容積也是很大的，如我們公司使用的是5噸容量的罐。巨大的體積給乙醇濃度和pH值的調(diào)節(jié)帶來了一些問題。顯然我們不可能像在實驗室中那樣一邊加入緩沖液一邊攪拌，同時用pH計直接測試。實際采取的方法是：準(zhǔn)確抽取10ml的溶液，滴定至指定的pH值，然后將所用的緩沖液量擴(kuò)大到一個罐的反應(yīng)液所需的量。一般情況下，需要加入的緩沖液量都會有數(shù)十千克，50%的乙醇大概會有500千克以上，往反應(yīng)罐中加入這些液體的時候一定要控制好速度，加得太快會使局部pH值或酒精濃度超出限度而導(dǎo)致不良后果，加得太慢則會拖長生產(chǎn)周期。沉淀反應(yīng)完成以后，需要將反應(yīng)液靜置數(shù)小時，以利于沉淀的積聚（一般還會按一定的比例往反應(yīng)液中加入硅藻土作為助濾劑），而后就可以進(jìn)行分離，以收集沉淀，同時將上清液轉(zhuǎn)移入另外的反應(yīng)罐以備進(jìn)行下一步的沉淀反應(yīng)。現(xiàn)今最常用的分離器具是壓濾機(jī)（以前也經(jīng)常使用高速離心機(jī)來分離沉淀，但其使用成本和工人的勞動強(qiáng)度均比壓濾機(jī)要高，因此逐漸被壓濾法取代），它其實就是一臺大型的板框濾器，配合相應(yīng)規(guī)格的濾板，反應(yīng)液在壓縮空氣或泵的驅(qū)動下穿過濾器，沉淀被濾板截留在板框中，待液體過完后一并取出。每臺壓濾機(jī)大概可以容納400千克以上的沉淀。

步驟③：20%乙醇沉淀反應(yīng)，分離出組份II+III沉淀，其主要成份為各種類型的球蛋白和凝血因子II、VII、IX、X。組份II+III沉淀可以用于免疫球蛋白類制品和人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)。上清液繼續(xù)進(jìn)入下一步的反應(yīng)。

步驟④：40%乙醇沉淀反應(yīng)，分離出組份IV沉淀，主要成份為球蛋白、銅藍(lán)蛋白和一些補(bǔ)體蛋白，同時還含有少量的白蛋白。組份IV沉淀也可以用于回收分離白蛋白。上清液繼續(xù)進(jìn)入下一步的反應(yīng)。

步驟⑤：40%粗制反應(yīng)，分離出組份V沉淀，也就是白蛋白，一般5000千克的血漿大約能得到600千克左右（具體的量和沉淀的干濕程度等都有關(guān)系）的組份V沉淀，其蛋白含量約為25%~28%。上清液中僅含少量的蛋白，直接棄去。此步驟分離出的白蛋白還不是很純，需要再進(jìn)行一次純化反應(yīng)。

步驟⑥：白蛋白純化反應(yīng)。通過這個步驟得到的白蛋白溶液，其純度已經(jīng)可以達(dá)到95%以上，但其中仍含有大量的乙醇和鹽類，需要通過超濾的方法將其去除。

步驟⑦：超濾脫醇及配制、滅活。這個步驟主要是去除蛋白溶液中的鹽類和乙醇，然后加入一定量的辛酸鈉，最后進(jìn)行60℃10小時的巴氏滅活以確保人白制品的病毒安全性。血液制品在超過60年的使用歷史中，只有經(jīng)過巴氏滅活的人血白蛋白才被公認(rèn)為是安全制品。辛酸鈉在這里起的是保護(hù)劑的作用，一定濃度下可以幫助白蛋白忍受住60℃10小時的保溫過程，但如果辛酸鈉濃度過高，它也可能會保護(hù)病毒度過巴氏滅活。另外，如果是以組份IV沉淀為原料生產(chǎn)的白蛋白，由于其中含有較高濃度的PKA（激肽釋放酶原復(fù)合物，有降壓作用），在超濾脫醇前必須經(jīng)過層析以去除大部分的PKA而保證制品的安全性。由于人血白蛋白為生物活性物質(zhì)，無法承受劇烈的滅菌條件，所以，滅活完的蛋白溶液經(jīng)過0.22微米的濾器過濾，就可以進(jìn)行分裝，這也對前面的各生產(chǎn)步驟提出了較高的潔凈度要求。一般每5000千克血漿可以得到10克/瓶的人血白蛋白約12000支。

步驟⑧：最后的處理。分裝完畢后，制品還需要在30—32℃下放置14天，而后進(jìn)行逐瓶燈檢，觀察其穩(wěn)定性指標(biāo)和外觀情況。同時取樣送檢測部門，待結(jié)果合格后才能投入銷售。

一批人血白蛋白從開始投料到可以銷售，大概需要一個半月到兩個月多的時間。

低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白已經(jīng)是一個比較成熟的方法，現(xiàn)今的主要問題就是如何進(jìn)一步提高人血白蛋白的得率，這主要牽涉到各步驟的一些細(xì)微注意點，也是我們的技術(shù)部門一直在追求的目標(biāo)。

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注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”