不同制備方法測定銀黃滴丸中綠原酸含量的分析

孫振平，于德龍，于 毓，仲 娜

（1. 青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071 ；2. 青島市城陽區人民醫院，山東 青島 266108）

銀黃滴丸是一種中成藥配方制劑，含有金銀花及黃芩的提取物等成分，臨床常用于治療上呼吸道感染、急慢性咽喉炎、肺熱咳嗽、目赤腫痛等病癥[1-3]。綠原酸（Chlorogenic Acid，CA）是金銀花提取物的主要成分，具有抗病原微生物、解熱、調脂、抗炎、增強機體免疫力等作用[4-5]。CA 分子結構中有酯鍵、多元酚等不穩定部分，衰減較快，在水中極易水解，且對光、熱穩定性均較差，常溫條件下保存，隨著時間的延長CA 含量會不斷下降[6-7]。在樣品提取過程中，往往因水解和分子內酯基遷移發生異構化等多種因素而導致有效成分的提取率明顯下降。本文通過相關試驗，建立供試品溶液最優制備方法，用以測定銀黃滴丸中CA 含量。

1 儀器與材料

LC-10Atvp 島津高效液相色譜儀；N2000 色譜工作站（浙江大學智達信息工程研究所）；TU1800S 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ3200 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli Q 超純水機（法國Millipore 公司）；CA 對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753 - 200212，供含量測定用）；銀黃滴丸（自制）；乙腈（色譜純）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 線性關系考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4% 磷酸溶液（13:87），流速：1.0 mL/min ；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃。理論板數為CA 峰計算不低于3000[8-9]。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取CA 對照品2.2 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為母液。精密量取母液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 至10 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖 勻， 即 得 濃 度 為4.4 μg/mL、8.8 μg/mL、17.6 μg/mL、26.4 μg/mL、35.2 μg/mL、44 μg/mL 的對照品溶液（10℃以下保存）。分別精密吸取上述對照品溶液各20 μL 進樣，記錄色譜圖（見圖1），測定峰面積并進行線性回歸（Y 表示峰面積，X 表示濃度），得回歸方程：Y=47128.82X-4952.86，r=0.99999 ；結果表明CA 在0.088 ～0.88 μg 范圍內有良好的線性關系。

圖1 對照品色譜圖

2.2 精密度試驗

精密吸取上述對照品溶液各20 μL，重復進樣6 次，以峰面積計算相對標準偏差（RSD），結果顯示RSD=0.22%。RSD 小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取方法的選擇 取本品，分別采用A. 超聲波提取、B. 回流提取、C. 冷浸提取三種方法比較提取率，具體如下：A. 超聲波提取：取重量差異項下的本品，研細，分別取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇，定容至25 mL，超聲處理30 min，放至室溫，濾過，精密量取續濾液1 mL，置10 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇至刻度，搖勻，濾過（0.45 μm 濾膜），濾液作為供試品溶液。B. 回流提取：按照超聲波提取法操作，取樣品0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，加熱回流30 min，放至室溫，其余同A。C. 冷浸提取：按照超聲波提取法操作，取2 份樣品各0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，冷浸提取30 min，放至室溫，其余同A。按照上述色譜條件，分別測定上述三種提取液中CA 的含量，記錄色譜圖（見圖2），結果見表1。結果表明，超聲法提取率最高，主成分損失最小，故本文選擇超聲提取法。

圖2 樣品色譜圖

表1 不同提取方法CA 含量的比較（mg/g）

2.3.2 提取溶劑的選擇 分別取本品，研細，取2 份各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50%甲醇、50%乙醇、甲醇、乙醇四種不同溶劑，定容至25 mL，分別超聲提取30 min，取出，放冷至室溫，其余同超聲波提取法。按上述色譜條件測定CA 含量，結果見表2。結果表明，甲醇、乙醇提取分離不好，50% 甲醇提取含量最高，故本文選擇50%甲醇作為提取溶劑。

表2 提取溶劑考察結果（mg/g）

2.3.3 提取時間的選擇 取本品，研細，取2 份各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 甲醇，定容至25 mL，分別超聲提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，取出，放冷至室溫，其余同超聲波提取法。按上述色譜條件測定CA 含量，結果見表3。結果表明，超聲提取30 min 后，CA 含量不再增加，故本研究選擇超聲提取30 min。

表3 不同提取時間CA 含量的比較

2.3.4 制備方法統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件對提取方法、提取溶劑、提取時間行ANOVA 分析，由表4 可見，提取方法、提取溶劑、提取時間組間影響差異不顯著，經方差分析，由方差大小可見影響提取的順序為B ＞A ＞C ；提取溶劑對提取效果影響最大，見表5。在CA 含量測定中，以50%甲醇超聲提取30 min 為供試溶液的最佳制備方法。

表4 ANOVA 統計分析

表5 方差分析

2.4 穩定性試驗

以經驗證的制備方法制備供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 分別進樣20 μL，測得供試品中CA 峰面積分別為820586.875、828743.813、828833.063、821822.875、821823.500、826982.438、828647.250，平均峰面積為825348.545，RSD=0.46%，表明本法穩定性較好。

2.5 重復性試驗

取6 份銀黃滴丸樣品（批號為20190601），分別為0.5036 g、0.4994 g、0.5100 g、0.5024 g、0.5203 g、0.5321 g，按供試品溶液制備方法制備并測定CA 含量分別為6.28 mg/g、6.28 mg/g、6.38 mg/g、6.22 mg/g、6.27 mg/g、6.27 mg/g，平均6.28 mg/g，計算RSD= 0.8%（n=6），表明本法重復性較好。

2.6 回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20040401）約0.25 g，精密稱定，分別加入相當樣品含量100% 的對照品，按照供試品制備方法操作，測定CA 含量，計算回收率，結果見表6。

表6 回收率實驗結果

2.7 樣品測定

取本品10 個批次的樣品各0.5 g，分別按照上述制備方法制備供試品溶液并測定CA 含量，結果見表7。

表7 樣品測定結果

3 討論

CA 分子結構中有酯鍵、多元酚等不穩定結構，衰減較快，穩定性差，在水中極易水解，在甲醇、乙醇中相對穩定，且對光、熱均不穩定。因此，樣品的前處理可直接影響CA 含量測定的準確性。本文比較了三種提取方法、四種提取介質、五個提取時間對CA 含量測定的影響。經方差分析，提取介質對樣品制備影響最大，影響順序為提取溶劑、提取方法、提取時間。經比較發現，用甲醇提取分離效果差，乙醇提取率較低，以50% 甲醇超聲提取30 min，樣品提取率高，方法穩定性、重復性均良好，可很好地控制銀黃滴丸中CA 的含量。