農桿菌介導的基因瞬時表達技術及其應用

摘要：主要介紹了農桿菌介導的基因瞬時表達方法的原理、技術、影響因素及其在外源基因表達分析、啟動子分析、基因沉默及防衛反應等方面的應用。

關鍵詞：農桿菌；植物；基因瞬時表達

中圖分類號：Q789文獻標識碼：A文章編號：1006—6500(2008)01—0020—03

把外源基因導入受體植物內，是研究基因功能和獲得遺傳修飾有機體的主要手段。農桿菌介導法是目前最常用的遺傳轉化方法，當農桿菌感染植物受傷組織后，質粒上的目標基因可以進入植物細胞內并整合到植物染色體中，這種轉化細胞經過誘導分化，再生成為轉基因植株。通常大多數植物的遺傳轉化和再生效率低下，費時且費用昂貴。即使對于轉化程序大大簡化的植物，例如擬南芥，仍然需要花費數月的時間來產生適合分析的轉基因植株。農桿菌介導的瞬時表達提供了一種快速分析基因型功能的方法，該方法是Rossi等在1993年創建的。他們將帶有重組質粒的農桿菌，經誘導后通過抽真空滲透入植物葉片進而滲透入植物細胞，通過目的基因瞬時表達來檢測植物中農桿菌介導的T-DNA轉移的效率。隨后人們又采用針管注射活體植株葉片，來進行農桿菌介導的基因瞬時表達檢測。近幾年該項技術不斷完善、發展，已被廣泛用于外源基因表達分析、無毒基因與抗性基因的相互作用、基因沉默、啟動子分析等許多植物分子生物學領域。

1 主要原理

農桿菌介導的瞬時表達是將目的基因插入共整合載體或雙元載體，轉化根癌農桿菌，后者經酚類化合物誘導處理后，通過真空滲透或針管注射入植物葉片組織中，農桿菌在葉片內與植物細胞緊密接觸。誘導處理在轉錄水平激活Vir區基因，真空滲透或注射使得農桿菌與植株葉片細胞接觸，從而實現了T-DNA轉移進入植物細胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因組而是暫時存在于核內并在植物細胞轉錄、翻譯成分的協助下瞬時表達T-DNA基因，通常在數小時后即可檢測到外源基因的表達，并在1～2d內達到最高值。而少量整合進植物染色體的T-DNA在瞬時表達中不起作用或極為微弱。

2 技術介紹

該技術主要包括載體的構建、農桿菌的培養及誘導、真空滲透或針管注射3個主要步驟：(1)將目的基因插入共整合載體或雙元載體，如pBI121、pMOG800、pBIN91、pTJK136等；轉化農桿菌，如LBA4404、EHA105、C5851等；(2)農桿菌的培養及誘導，將農桿菌培養液按1％(v/v)轉接于含抗生素、2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(MES)和乙酰丁香酮(AS)的液體培養基中，振蕩培養至對數生長期，離心收集菌體，重懸于MMA溶液(含MgCl₂、MES、AS)中，并調整菌液濃度使其OD₆₀₀=1.5左右，室溫靜置3h；(3)真空滲透或針管注射，真空滲透法一般是將離體葉片浸入菌液中，抽真空一定時間并迅速釋放使得菌液滲入葉片內，把處理后的葉片放入盛有用無菌水或MS培養液浸濕的濾紙的培養皿中，培養一段時間后取樣檢測。針管注射法是用無針頭的針管，靠壓力將菌液注入葉片的葉脈之間，除了Rossi等最初使用真空滲透處理幼苗、Kapila等用真空滲透處理葉片外，現多采用針管在完整植株上注射葉片，因為后者能更真實地反映葉片在植株上生長過程中基因的表達情況。

3 影響因素

因為農桿菌介導的瞬時表達同時有兩個生物體參加這一過程，影響農桿菌的侵染力和植物生理狀況的因素都會影響轉化的效率。對于某一特定的植物種類，農桿菌的一些菌株比另外的菌株的侵染力更強。同樣，一些植物種類或基因型對于特定的農桿菌菌株具有更多或更少的感受性。這些變化部分是由于微生物接近植物細胞的能力不同，或者是因為微生物或植物編碼的T-DNA轉化機制的不同造成的。

植株和葉片的生理狀況在很大程度上影響到瞬時表達的轉化效率，Yang等用針管注射GUS基因來檢測其在煙草葉片中的瞬時表達活性時發現：完全展開的老葉片轉化效率低；半展開的嫩葉在不同葉片之間，或同一葉片的不同區域的轉化效率變化很大；6周齡植株的中部即將完全展開的葉片的轉化效率相互之間變化小、可重復性強。這可能是因為老葉片難于注射且細胞內轉錄活性降低；嫩葉的生理狀況相互之間差別大、葉肉細胞間菌體滲透不勻，而即將完全展開的葉片生理狀況相對穩定且易于注射。

微生物懸液的濃度對滲透也很重要。懸液的OD₆₀₀₂值小于0.1導致弱的轉基因表達；而OD₆₀₀值高于1.0的懸液的滲透通常導致組織黃化或枯萎。對萵苣的測試表明，滲透的懸液的OD₆₀₀值在0.3和0.8之間。

曾有報道提及一些化學和生化因素在不同植物中提高了瞬時表達的效率，這些因素包括乙酰丁香酮、滲透過程中pH值的不同范圍、L-半胱氨酸和重氮絲氨酸。但這些因素對瞬時轉化的影響作用并不是普遍發生的情況，它們可能只在特定的實驗中起作用。

4 應用

外源基因的瞬時表達是十分理想的研究基因表達調控的實驗系統。具體可應用于以下幾個方面：

4.1 外源基因表達分析

Joh等通過真空滲透法處理萵苣葉片，得到高水平瞬時表達的重組蛋白，雖然表達水平不穩定，但是為利用植物來大量生產重組蛋白提供了一個有希望的技術。

4.2 啟動子對基因表達調控的研究

Yang等通過農桿菌介導的瞬時表達對煙草啟動子和轉錄因子進行了快速分析，通過注射煙草葉片成功地識別了煙草PR1a和myb1兩個啟動子中對水楊酸(SA)處理、煙草花葉病毒(TMV)感染有響應的順式作用元件。該實驗的結果表明農桿菌介導的瞬時表達是一個簡單而有效的體內分析植物啟動子和轉錄因子的手段。

4.3 基因沉默研究中的應用

基因沉默現象是導致轉基因不能正常表達的一個重要因素。其作用機理主要有：位置效應、轉錄水平的沉默和轉錄后水平的沉默。病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silence，VIGS)是近年來發現的一種轉錄后基因沉默(post-transcription-al gene silencing。PTGS)現象，它為功能基因組學研究提供了一個有力的工具。

Diego等利用農桿菌將基于煙草病毒的pTRV1、TRV2-tPDS復合物注射番茄果實，發現八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS)的mRNA水平需要達到一定閾值才能引發番茄紅素的積累，證明了農桿菌介導的瞬時轉化對于果實中的基因沉默是一種有效的傳遞系統。

4.4 宿主抗性(R)基因與病原物無毒(Avr)基因的相互作用研究

現在一般認為抗性是植物品種所具有的抗性基因和與之對應的病原物的無毒基因結合時才得以表現。過敏反應(Hypersensitive reaction，HR)是宿主的局部防衛反應，它是在非親和性病原感染后在病原侵染部位產生的抗病反應，侵染部位細胞編程死亡。

Palanichelvam等通過瞬時轉化在煙草葉片上表達CaMV W260株的VI基因，4～5d引起過敏反應，9～12d引起細胞死亡。

Van der Hoorn等通過Agrobacterium成功地在分別轉有抗性基因Cf-9和Cf-4的煙草葉片中表達了來源于番茄葉霉菌的胞外蛋白基因Avr9和Avr4，并認為農桿菌介導的瞬時表達是研究Avr/Cf介導的識別反應的一個靈活又可靠的手段，更重要的是該方法可用來對比、量化Avr/Cf反應。該實驗第一次表明該方法可用來研究胞外識別反應。

5 展望

從開始的真空滲透到現在的針管注射，農桿菌介導的瞬時表達開辟了一個基因表達分析的新途徑。農桿菌介導的瞬時表達比轉基因植株的穩定表達和其他瞬時表達方法具有更多優點。它比微粒轟擊法和原生質體轉基因方法操作更簡便、比穩定轉化能更快速有效地分析對生長和擴增起影響作用的基因。另外，瞬時表達單基因的組織數量也很豐富，從而可以進行RNA和蛋白分析，對于植物蛋白生產有潛在的用途。但是目前瞬時轉化法仍具有一些局限性，它僅僅在部分植物中有效，更重要的是，只有那些能夠幾天內在目標組織(通常葉片)中提供可測定現象的基因才可被用來進行瞬時分析。相信隨著技術的完善，這一方法會在植物分子生物學研究中發揮越來越重要的作用。