抑癌ｐ５３基因在星形細胞瘤中陽性表達的意義

【摘要】 目的 研究p53在星形細胞瘤發(fā)生、增殖過程中的作用及臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)法(S-P法)檢測62例資料完整的星形細胞瘤及10例正常腦組織的p53表達，分析p53蛋白在星形細胞瘤及正常腦組織中的表達情況。結(jié)果 正常腦組織中未見p53蛋白陽性表達，62例星形細胞瘤中共有26例腫瘤p53蛋白表達呈陽性，二者差異有顯著性（χ²=4.872，P＜0.05），其中在Ⅰ級星形細胞瘤中陽性率為8.33%(1/12)，Ⅱ級星形細胞瘤中陽性率為21.05%(4/19)，Ⅲ級間變性星形細胞瘤中陽性率為 60%(9/15)，Ⅳ級膠質(zhì)母細胞瘤中陽性率為75%(12/16)。結(jié)論 星形細胞瘤中p53蛋白的表達與腫瘤的級別相關(guān)，分化程度越低，p53蛋白陽性表達率越高，檢測p53有助于臨床判斷預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】 星形細胞瘤；抑癌p53基因；免疫組織化學(xué)

文章編號：1003-1383(2008)03-0250-03中圖分類號：R 361 文獻標(biāo)識碼：A

The significance of anti-oncogene p53 positive expressionin astrocytoma

XUE Jianrong1，QIN Kunming2，CHEN Jiakang1，LU Jiangwu1，WEN Chaoyong1

（1.Department of Neurosurgery，the Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Liuzhou，545005;2.Department of Neurosurgery， the First AffiliatedHospital of Guangxi Medical University，Nanning，530021）

【Abstract】 Objective To investigate the role of p53 during the proccess of the astrocytoma occurrence and cell proliferation，so as the clinical significance.

Methods Thepositive expression of p53 protein were detected in the specimens of 62 cases of astrocytoma by S-P immunological technique，aside with 10 cases of normal brain tissue. Then the expression of p53 protein in these tissues were analysed.

Results There were 26 cases positive expression of p53 protein in 62 astrocytoma specimens and no positive expression of p53 protein in the normal brain tissue. It showed a significant diversity between the two groups(χ²=4.872，P＜0.05). The positive percentage was 8.33%(1/12) in grade I astrocytomas，21.05%(4/19) in grade II astrocytomas，60%(9/15) in grade III anaplastic astrocytomas(AA) and 75%(12/16) in grade IV glioblastoma multiforme(GBM).

Conclusion The results reveal a correlation between p53 protein expression and histopathological typing and grading in astrocytomas. The degree of cell differentiation is lower， the ratio and intensity of p53 expression is obviously higher， which can help to evalue prognosis.

【Key words】 astrocytoma；anti-oncogene p53；immunohistochemistry

星形細胞腫瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，約占膠質(zhì)瘤21.2﹪～51.6﹪，因生長迅速，侵襲性強，與正常腦組織分界不清，治療棘手，易復(fù)發(fā)。近年來，隨著研究的深入，人們認(rèn)識到作為重要的抑癌基因之一的p53基因若發(fā)生突變，其基因編碼的突變p53蛋白具有促進細胞無序增殖，演變成腫瘤，并且滅活正常的p53蛋白。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測p53蛋白在星形細胞瘤中的表達。

資料和方法

1.臨床資料

收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2004～2005年臨床和病理資料完整的星形細胞瘤62例，其中男39例，女23例，年齡16～81歲，平均39±13.72歲。腫瘤部位：額葉18例，顳葉13例，頂葉9例，枕葉5例，顳頂葉7例，小腦5例，腦干1例，脊髓4例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療和化療，所收集標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋處理，每例石蠟標(biāo)本病理結(jié)果由兩名富有經(jīng)驗的神經(jīng)病理學(xué)專家確診，分級依據(jù)WHO₂000年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ級星形細胞瘤12 例、Ⅱ級星形細胞瘤19 例，Ⅲ級間變性星形細胞瘤15 例，Ⅳ級膠質(zhì)母細胞瘤16 例。另收集10例因重型顱腦損傷而行顱內(nèi)減壓手術(shù)切除的正常腦組織制成石蠟標(biāo)本作為陰性對照。所有標(biāo)本均制成厚4 μm連續(xù)組織切片，置于已經(jīng)過膠(APES)的清潔載玻片上。

2.方法 采用免疫組化染色法（S-P法），所有試劑均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。切片經(jīng)烤片，脫蠟，梯度酒精水化，3％H2O₂滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，微波抗原修復(fù)，10%正常山羊血清封閉，濕盒內(nèi)孵育在同一組織蠟塊所切的組織切片分別加入p53單克隆

抗體，PBS代替一抗作為空白對照， PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液（抗小鼠），均置于濕盒內(nèi)，37℃孵育30分鐘，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶（辣根過氧化物酶）；DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水中反藍；封片后顯微鏡觀察結(jié)果。采用試劑公司提供的陽性組織切片作陽性對照，PBS代替一抗作空白對照。正常腦組織標(biāo)本切片作為陰性對照。

3.結(jié)果判定 細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即定為陽性，無棕黃色顆粒為陰性。每張切片選取具有代表性的腫瘤區(qū)域在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個以上視野，計數(shù)1000個腫瘤細胞，計陽性細胞百分率，壞死區(qū)和血管內(nèi)皮細胞不被計算在內(nèi)。

4.統(tǒng)計學(xué)處理 根據(jù)實驗資料的性質(zhì)，對于所得數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows 13.0統(tǒng)計軟件進行χ² 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.p53在星形細胞瘤和正常腦組織中的表達情況 p53在星形細胞瘤和正常腦組織的表達率分別為41.94%和0%，經(jīng)卡方檢驗，二者差異有顯著性意義（χ²=4.872，P＜0.05），見表1。p53在星形細胞中的陽性表達見圖1。

2.p53在各級別星形細胞瘤中的表達情況

星形細胞瘤級別不同，p53蛋白陽性表達情況不同，差異有顯著性意義（χ²=18.161，P＜0.01）。隨著星形細胞瘤級別的提高，陽性表達率增高，見表2。

討論

現(xiàn)代分子生物學(xué)理論認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生主要是由于原癌基因的激活或抑癌基因的失活，造成細胞增殖周期的失控而形成。p53基因是抑癌基因的一種，定位于人17號染色體短臂上(17p13.1)，有11個外顯子和10個內(nèi)含子，起著防止腫瘤發(fā)生的作用，主要生物學(xué)功能是對細胞增殖、凋亡、分化起負性調(diào)控作用，通過獨立和非獨立機制確保細胞進入有效的死亡程序過程，其他p53基因家族成員也能夠促進腫瘤細胞的程序性凋亡，這一作用與p53基因并行或協(xié)調(diào)［1］。p53可由于多種細胞應(yīng)激而激活，包括DNA損傷、組織缺氧和促有絲分裂的腫瘤基因。p53基因應(yīng)對細胞過多增殖而激活，其腫瘤抑制活力來源于消除存在腫瘤基因表達的細胞［2］。

在各種致癌因子作用下，p53基因發(fā)生突變后，失去野生型的各種生物功能，不能保持基因的穩(wěn)定性，不能夠發(fā)揮程序性凋亡作用，從而促進腫瘤的發(fā)生和抗藥性［3］。當(dāng)發(fā)生p53基因突變和雜合、丟失、重排而失活時，常引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［4］。Gil-Perotin等研究室管膜下區(qū)膠質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)p53缺失提供了該區(qū)細胞群全速或快速增殖的優(yōu)勢，這與迅速出現(xiàn)的變異相關(guān)，細胞數(shù)量和密度增加，當(dāng)缺乏p53的誘變刺激時，導(dǎo)致細胞自我更新及分化功能受損的變化，這可能是成人室管膜下區(qū)慢增殖細胞產(chǎn)生膠質(zhì)瘤的機制［5］。正常腦發(fā)育過程中神經(jīng)膠原控制途徑異常，如神經(jīng)干細胞分化成星形細胞的過程，可能導(dǎo)致多型性膠質(zhì)母細胞瘤形成，這些途徑包括生長因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細胞周期進程的控制過程，例如p16-CDK4-RB和ARF-MDM2-p53途徑［6］。p53基因突變后其編碼的蛋白構(gòu)象也發(fā)生了改變，半衰期延長，在細胞中穩(wěn)定性增加。由于其半衰期延長能夠被免疫組化法檢測出來，因而可作為p53基因突變的間接指標(biāo)。

本實驗顯示p53蛋白陽性表達主要位于細胞核，免疫組織化學(xué)呈棕黃色染色。p53蛋白陽性細胞呈局灶性、分散性不均勻分布。正常腦組織中無p53蛋白陽性表達，而星形細胞瘤中p53蛋白陽性表達率為41.94%，二者之間的差異有顯著性（χ²=4.872，P＜0.05），這進一步證實了p53在星形細胞瘤的發(fā)生中起重要作用。隨著腫瘤分級的增高，p53蛋白陽性細胞數(shù)表達率也增高(χ²=18.161，P＜0.01)，這表明突變型的p53基因的存在與星形細胞瘤的惡性程度有關(guān)。Ganigi等回顧性分析54例年齡從9歲到15歲的部位不同的兒童多型性膠質(zhì)母細胞瘤，發(fā)現(xiàn)p53在53.7%病例中免疫組化反應(yīng)陽性，其中主要是位于丘腦(75%)和大腦半球(62.2%)的多型性膠質(zhì)母細胞瘤，其次是位于腦干的腫瘤 (30%)，而在小腦腫瘤不表達p53蛋白。與p53陰性表達的腫瘤相比，p53陽性的的腫瘤具有高的MIB-1（Ki-67） LI (P=0.003。p53 和bcl-2陽性表達的病人預(yù)后差，并且p53在幕上腫瘤表達更多，認(rèn)為p53和bcl-2陽性表達與不良預(yù)后相關(guān)［7］。本實驗中p53蛋白在多型性膠質(zhì)母細胞瘤中的表達率比Ganigi的結(jié)果略高，可能是因為選取病例的年齡段不同，腫瘤部位不同的原因也不能排除，本實驗的病例年齡跨度大，多位于幕上。Deb等認(rèn)為多型性膠質(zhì)母細胞瘤生存期（中位數(shù)）為10～12月，超過3年到5年的很少，他研究6例平均生存時間達9年（范圍5～15年）多型性膠質(zhì)母細胞瘤，發(fā)現(xiàn)其中的5個病例中有4個p53蛋白免疫表達呈陽性，MIB-1LI平均為12% (范圍6%～20%)，認(rèn)為對于有少突膠質(zhì)細胞和（或者）巨細胞組成的年輕的病人，包括有增殖指數(shù)和p53表達的，應(yīng)該謹(jǐn)慎的評價預(yù)后，這部分病人可能有預(yù)后的不確定性［8］。可見，p53 對于星形細胞瘤的腫瘤分級有一定的幫助，可作為判斷星形細胞瘤惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)。

參考文獻

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(收稿日期：2008-03-31 修回日期：2008-06-13)

(編輯：潘明志 英文審校：唐雄林)