糖尿病腎病大鼠腎組織周期素Ｄ１與周期素依賴性激酶４的表達及意義

【摘要】 目的 探討周期素D1（CyclinD1）與周期素依賴性激酶4（CDK4）在糖尿病腎病發生、進展中的作用。方法 通過注射鏈尿佐菌素建立糖尿病腎病大鼠模型，采用免疫組織化學法檢測CyclinD1、CDK4的表達。結果 糖尿病腎病大鼠腎組織表現為系膜細胞等中、重度增生，CyclinD1、CDK4表達水平明顯上調，二者呈正相關。結論 CyclinD1、CDK4參與了糖尿病腎病中腎固有細胞的增殖，是糖尿病腎病發生和進展的關鍵機制。

【關鍵詞】 糖尿病腎病；大鼠；CyclinD1；CDK4

文章編號：1003-1383(2008)03-0245-03中圖分類號：R 322.6+1 文獻標識碼：A

Expression and Significance of CyclinD1，

CDK4 in Nephridial Tissue of Rats Diabetic Nephropathy

YOU Yanwu，LIN Xu，YANG Fafen，WANG Jie，GUO Pengwei

(Dept. Nephrology，Affiliated Hospital，Youjiang Medical College for

Nationalities，Baise 533000，Guangxi China)

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of CyclinD1，CDK4 in the occurrence， development of diabetic nephropathy.

Methods The rats model of diabetic nephropathy were established by injected STZ. The expression of CyclinD1，CDK4 were detected by immunohistochemistry.

Results The nephridial tissue of rats diabetic nephropathy present mesangial cells was found moderate to severe hyperplasy. The express level of CyclinD1 and CDK4 up-regulated obviously， there was significant positive correlation in both(P＜0.05).

Conclusion CyclinD1 and CDK4 participate proliferation of kidney eigen cells in diabetic nephropathy， they are the key mechanism in the occurrence， development of diabetic nephropathy.

【Key words】 Diabetic nephropathy;rats;Cyclin D1;CDK4

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的嚴重并發癥之一，其發病機制尚未完全清楚。糖尿病腎病典型的病理改變包括腎臟肥大、基底膜增厚、腎小球細胞外基質成分積聚等，而腎臟固有細胞的增殖或肥大是引起腎臟肥大、細胞外基質增多的中心環節，并進一步導致腎小球硬化、小管間質纖維化。細胞周期素(Cyclins)和周期素依賴性激酶（Cyclin dependence kinases，CDKs）是調節細胞增殖的關鍵因子，推測其在糖尿病腎病的發生、進展中起著重要作用。本研究通過檢測糖尿病腎病大鼠腎組織中CyclinD1與CDK4的表達，探討細胞周期調節蛋白在糖尿病腎病發生、進展中的作用。

材料和方法

1.糖尿病腎病大鼠模型的建立 選用SD雌性大鼠20只，重200～250 g，隨機分為兩組，即糖尿病腎病組（DN group）、對照組（Control group）。糖尿病腎病組給予單次左下腹腔注射50 mg/kg的鏈尿佐菌素（STZ），STZ用pH4.5的檸檬酸緩沖液溶解至濃度10 g/L，注射后連續三天測尾靜脈血糖，若血糖低于＜16.7 mmol/L者被排除（于第4周開始出現明顯蛋白尿）；對照組僅予注射pH4.5的檸檬酸緩沖液。飼養8周。

2.標本收集 第8周用代謝籠收集大鼠24小時尿液以測定尿白蛋白排泄率(Urinary Albumin Excretion Rate， UAER)，用乙醚吸入麻醉后，經心臟取血，分離血清以測定血膽固醇(CHO)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)，計算內生肌酐清除率（Ccr）；取出腎臟，分離包膜后部分置10%中性福爾馬林液浸泡固定，待作光鏡檢查、免疫組化。

3.光鏡下分析腎臟病理改變 腎組織切片行HE、PAS染色后于光鏡下用彩色病理圖像分析系統分析腎臟病理改變。

4.免疫組化分析 免疫組織化學SP法，其中依次滴加兔抗CyclinD1或兔抗CDK4、生物素標記的羊抗兔IgG、辣根

酶標記的鏈酶卵白素液等，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液替代一抗作陰性對照。染色后于光鏡下用彩色病理圖像分析系統分析其表達情況，于高倍鏡下每張切片取5個視野分析陽性區域的灰度值。

5.統計學處理 實驗數據以-±s表示，應用統計軟件SPSS11.0對所有數據行方差分析，組間比較用q檢驗，相關關系采用雙變量相關分析，P＜0.05有統計學差異。

結果

1.生化指標 DN組大鼠第三天血糖、24小時UAER、血膽固醇、內生肌酐清除率、尿素氮水平均較對照組明顯升高（P值均為0.001）。見表1。

2.光鏡下腎臟病理改變 糖尿病腎病大鼠腎組織表現為以系膜細胞為主的腎固有細胞中、重度增生，系膜區基質增生，系膜區擴大，基底膜增厚，腎小球體積明顯增大等改變。

3.腎組織中CyclinD1、CDK4表達及兩者間的關系CyclinD1、CDK4主要表達于系膜細胞、足細胞，少量表達于內皮細胞、腎小管上皮細胞。在糖尿病腎病大鼠腎組織中CyclinD1、CDK4表達水平（0.44±0.05、0.39±0.02）均較對照組（0.21±0.03、0.25±0.03）明顯上調（P值均為0.001）；糖尿病腎病大鼠腎組織中CyclinD1表達水平與CDK4之間呈正相關關系(r=0.691，P=0.027)。見圖1～5。

討論

本研究中DN組大鼠有血糖顯著升高、大量蛋白尿、高脂血癥、腎功能損害表現，腎臟有典型糖尿病腎病的病理特點，提示糖尿病腎病大鼠模型成功建立。DN組大鼠腎臟固有細胞增殖的同時，腎組織中CyclinD1、CDK4表達上調，且CyclinD1、CDK4表達水平呈正相關關系，說明CyclinD1、CDK4參與了糖尿病腎病腎固有細胞增殖。

細胞周期中G0、G1、S、G2和M期的正常運轉均是由正性周期調節蛋白和負性周期調節蛋白的調節、控制及兩者的相互協調所調控的。正性周期調節蛋白包括細胞周期素(Cyclins)和周期素依賴性激酶(CDKs)。細胞增殖要求Cyclins結合并激活特異性的CDKs形成Cyclin-CDK復合物，才能發揮其特有的生物效應。CyclinD1是調節細胞由G1期進入S期的關鍵蛋白，與CDK4、6結合形成的酶復合物使特異性的酶解底物視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)及其相關蛋白p107、p130 磷酸化，引導細胞進入S 期，引起細胞增殖。

在哮喘小鼠氣道重建過程中，氣道平滑肌細胞增殖的同時伴有CyclinD1表達增加，證實CyclinD1表達增加參與了平滑肌細胞增殖［1］。在血管瘤中，血管內皮細胞大量增殖的同時，也可觀察到CyclinD1過度表達［2］。黃芬等［3］研究培養的人平滑肌細胞發現，隨著人平滑肌細胞增殖指數的增加，CyclinD1和CDK4表達呈上升趨勢。曾瑜等［4］檢測腎小球腎炎患者腎組織中CyclinD1，發現在腎小管上皮細胞和間質細胞中有CyclinD1表達，且表達與增殖細胞核抗原呈正相關，說明細胞周期調控蛋白參與了腎小管上皮細胞和間質細胞增殖。這些研究都證實了Cyclins與CDKs是細胞增殖的重要調節因子。

本研究通過檢測糖尿病腎病大鼠腎組織中CyclinD1與CDK4的表達，證實CyclinD1、CDK4參與了糖尿病腎病中腎固有細胞的增殖，說明CyclinD1、CDK4是糖尿病腎病發生和進展的關鍵機制，為尋求防治糖尿病腎病的有效措施提供了理論依據。

參考文獻

［1］卓致遠，黃 茂，葛海燕，等.哮喘小鼠氣道平滑肌細胞增殖及細胞周期蛋白D1 表達的差異［J］.南京醫科大學學報（自然科學版），2007，27（1）：43-46.

［2］馬 莉，康安靜，王康敏，等.細胞周期蛋白D1， E，A在血管瘤及血管畸形中的表達及意義［J］.中國皮膚性病學雜志，2007，21（1）：5-7.

［3］黃 芬，王華兵，王 麗，等.瘦素對血管平滑肌細胞周期蛋白D1、CDK2表達的影響［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2007，16（6）：621-624.

［4］曾 瑜，魏仁桂，李易娟，等。細胞周期調控蛋白在人類腎小球腎炎中腎小管及間質細胞的表達及其意義［J］.中華腎臟病雜志，2002，18（6）：408-412..

(收稿日期：2008-05-17 修回日期：2008-06-13)

(編輯：潘明志 英文審校：唐雄林)