扁玉螺ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的建立及其優(yōu)化

摘要：以扁玉螺基因組DNA為材料，分析了Mg²⁺、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響，建立了一套適合扁玉螺的ISSR-PCR反應(yīng)體系。該反應(yīng)體系包括：2.0 mmol·L^-1的Mg²⁺，0.25 mmol·L^-1的dNTP，0.8 U的Taq DNA聚合酶，0.2 μmol·L^-1的ISSR引物和40 ng模板DNA。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，從30條ISSR引物中篩選出13條擴(kuò)增效果較好的引物，為進(jìn)一步利用ISSR標(biāo)記研究扁玉螺的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：扁玉螺；ISSR-PCR；引物篩選

中圖分類號(hào)：Q75；S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114(2008)05-0575-03

Establishment and Optimization of the ISSR-PCR Reaction System for Neverita didyma

SUN Shi-wei1，SUN Zhen-xing1，CHEN Yan-ni1，WU Ke2

(1. Life Science College，Ludong University，Yantai 264025，Shandong，China；

2. The Eighth Elementary School，Economic-technological Development Area Yantai 264006，Shandong，China)

Abstract：The influence of Mg²⁺，dNTP，Taq DNA polymerase，ISSR primer and template DNA concentration on the result of ISSR-PCR amplification was analyzed using the genomic DNA of Neverita didyma. The ISSR-PCR reaction system was established for Neverita didyma. The reaction system was as follows：2.0 mmol·L^-1 Mg²⁺，0.25 mmol·L^-1 dNTP，0.8 U Taq DNA polymerase，0.2 μmol·L^-1 ISSR primer，40 ng template DNA. Using the optimized reaction system，13 primers with good polymorphism screened from 30 ISSR primers were used to conduct ISSR analysis. The result provided basis for further the analysis of genetic diversity of Neverita didyma by ISSR marker.

Key words：Neverita didyma；ISSR-PCR；primer screening

扁玉螺(Neverita didyma Roding)屬軟體動(dòng)物門、腹足綱、前鰓亞綱、中腹足目、玉螺科，是一種分布于我國(guó)黃渤海以及朝鮮半島、日本和東南亞沿海的貝類[1]，其個(gè)體較大，肉味鮮美，具有一定的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前人們對(duì)扁玉螺的利用主要是采捕野生資源，但由于其自然資源量正在逐步減少，扁玉螺已成為潛在的人工養(yǎng)殖開發(fā)對(duì)象。因此，研究扁玉螺種質(zhì)資源的遺傳多樣性，搞清其群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異，對(duì)于充分開發(fā)利用及保護(hù)扁玉螺資源都具有重要的意義。 ISSR(inter simple sequence repeat)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間的簡(jiǎn)稱，是近年來在微衛(wèi)星技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[2]。ISSR為顯性標(biāo)記，具有孟德爾遺傳特征，因此被廣泛地應(yīng)用于各種生物的遺傳多樣性分析、品種和種質(zhì)鑒定以及物種和種群親緣關(guān)系等方面研究[3-5]。有關(guān)扁玉螺分子遺傳標(biāo)記的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立并優(yōu)化扁玉螺的ISSR-PCR反應(yīng)體系，可為今后開展扁玉螺的分子遺傳學(xué)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化程序。

1 材料與方法

1.1 材料

扁玉螺采自山東煙臺(tái)近海，活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后解剖取足肌，放入-74℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ISSR引物和試劑

實(shí)驗(yàn)所用的30條ISSR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增和電泳所用的主要試劑，均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 模板DNA的制備

扁玉螺基因組總DNA的提取參照本實(shí)驗(yàn)室皺紋盤鮑基因組DNA的提取方法[6]。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)DNA純度，并按下式估算模板DNA的濃度：DNA濃度(μg·mL^-1)=50×(OD₂60-OD₃10)×稀釋倍數(shù)[7]

調(diào)整各樣品的DNA濃度相同，取8只個(gè)體的DNA，等量混合制備成模板DNA備用。

1.4 第1次篩選引物

篩選引物時(shí)采用兩次篩選。第1次篩選引物的條件為：PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL，其中，Mg²⁺ 2.5 mmol·L^-1，dNTP 0.25 mmol·L^-1，Taq DNA聚合酶1.5 U，ISSR引物0.2 μmol·L^-1，20 ng模板DNA；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，45個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min[4]。用PE-9600型PCR儀，按以上條件對(duì)所有引物進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)同時(shí)用0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(膠中含終濃度為1 μg·mL^-1的溴化乙錠)，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.6 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

用第1次篩選所獲得的電泳條帶效果最佳的2條ISSR引物進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，PCR反應(yīng)程序同上。反應(yīng)總體積仍為25 μL，對(duì)Mg²⁺、dNTP、Taq DNA聚合酶、ISSR引物、模板DNA等5個(gè)主要成分，參考有關(guān)文獻(xiàn)[8，9]分別設(shè)置3～4個(gè)不同的濃度梯度(表1)，以第1次篩選引物的條件為基礎(chǔ)，共設(shè)置13個(gè)不同試驗(yàn)組合(除去重復(fù)試驗(yàn)組合，表2)，逐一進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以獲得優(yōu)化的反應(yīng)體系。

1.7 第2次篩選引物

用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，對(duì)其余引物進(jìn)行第2次篩選。并對(duì)篩選出的引物進(jìn)行退火溫度試驗(yàn)，溫度梯度為50、52、54、55℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 Mg²⁺的濃度

在PCR反應(yīng)體系中，Taq酶的聚合作用需要一定濃度的Mg²⁺來激活，而且dNTP、引物、產(chǎn)物與模板DNA等都會(huì)與Mg²⁺結(jié)合，因此，Mg²⁺濃度是決定擴(kuò)增效果的一個(gè)重要因子。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)Mg²⁺濃度為1.5 mmol·L^-1時(shí)，產(chǎn)物條帶不夠清晰；Mg²⁺濃度為2.0 mmol·L^-1時(shí)，擴(kuò)增出的條帶最清晰；Mg²⁺濃度為2.5 mmol·L^-1時(shí)，條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。因此，在25 μL反應(yīng)體系中Mg²⁺的最適濃度為2.0 mmol·L^-1(圖1-a)。

2.2 Taq DNA聚合酶的用量

PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料自動(dòng)合成新的DNA鏈。同時(shí)，Taq酶的用量也受到反應(yīng)體系中其他因素的影響。當(dāng)Taq DNA聚合酶的用量較低時(shí)，擴(kuò)增條帶不明顯，不能產(chǎn)生足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物；當(dāng)Taq酶用量較高時(shí)，擴(kuò)增條帶的亮度增加，背景增強(qiáng)。本試驗(yàn)在Taq酶用量為0.8～1.5U時(shí)，均有擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，且差異不明顯(圖1-b)。本著滿足試驗(yàn)要求和節(jié)約成本的原則，我們采用Taq DNA聚合酶的用量為0.8 U。

2.3 dNTP的濃度

dNTP是PCR反應(yīng)體系中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。dNTP的質(zhì)量和濃度，與PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，其用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物的可靠性有關(guān)，直接影響到PCR反應(yīng)的速度和特異性[10]。dNTP量過少時(shí)，合成的產(chǎn)物減少；用量過多時(shí)，錯(cuò)配增多，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，重復(fù)性差。本試驗(yàn)比較了3個(gè)濃度水平對(duì)擴(kuò)增效果的影響，結(jié)果表明，不同的dNTP濃度均可擴(kuò)增出條帶，當(dāng)dNTP的濃度為0.25 mmol·L^-1時(shí)，擴(kuò)增效果最好，條帶清晰且較穩(wěn)定。因此，反應(yīng)體系中dNTP的濃度以0.25 mmol·L^-1為適宜(圖2-c)。

2.4 ISSR引物的濃度

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小以及擴(kuò)增靶序列在基因組中的位置是由引物限定的[10]。因此，引物濃度的選擇對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的量及特異性均有一定的影響。引物太少時(shí)，與模板結(jié)合的機(jī)率低，引物過多，則在反應(yīng)過程中易形成引物二聚體。合適的引物濃度，既能增加特異性又能增加靈敏性。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)ISSR引物濃度為0.2 μmol·L^-1時(shí)，條帶最清楚，擴(kuò)增效果最好(圖2-d)。

2.5 模板DNA的用量

本試驗(yàn)中，當(dāng)模板DNA的用量為20～80 ng時(shí)，都能擴(kuò)增出條帶，但以模板用量為40 ng時(shí)，擴(kuò)增效果較好。因此，在25 μL反應(yīng)體系中，我們采用40 ng的模板DNA用量。

2.6 關(guān)于退火溫度

PCR是一種級(jí)聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過程，包括變性、復(fù)性和延伸3個(gè)步驟。其中，復(fù)性過程中的退火溫度至關(guān)重要，對(duì)反應(yīng)的特異性起著主要作用。退火就是使引物和模板DNA復(fù)性，所以溫度過高，引物不能與模板很好的復(fù)性，擴(kuò)增效率低；溫度過低，引物將產(chǎn)生非特異復(fù)性，導(dǎo)致非特異DNA片段的擴(kuò)增。根據(jù)引物合成時(shí)給出的退火溫度Tm值，結(jié)合公式Tm=4×(G+C)+2×(A+T)[11]，一般GC含量高的引物，退火溫度較高；AT含量高的引物，退火溫度較低。本試驗(yàn)中設(shè)置了50、52、54、55℃4個(gè)梯度，對(duì)退火溫度進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)退火溫度為52℃時(shí)，大多數(shù)引物擴(kuò)增出的條帶都較為清晰穩(wěn)定。當(dāng)然，這一退火溫度對(duì)個(gè)別引物可能不是最適合的，考慮到電泳結(jié)果可滿足試驗(yàn)要求，并盡量簡(jiǎn)化試驗(yàn)程序，所以我們選擇退火溫度為52℃。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了一套適合扁玉螺的ISSR-PCR反應(yīng)體系，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為總體積25 μL，其中包含2.0 mmol·L^-1的Mg²⁺，0.25 mmol·L^-1的dNTP，0.8 U的Taq DNA聚合酶，0.2 μmol·L^-1的ISSR引物，40 ng模板DNA；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，45個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，從30條ISSR引物中篩選出13條多態(tài)性較好的引物，獲得了滿意的擴(kuò)增效果(圖3)，這為進(jìn)一步利用ISSR標(biāo)記研究扁玉螺種質(zhì)資源的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 齊鐘彥，馬銹同，王禎瑞，等. 黃渤海的軟體動(dòng)物[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.48-54.

[2] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20(2)：178-183.

[3] 王偉繼，孔 杰.ISSR-PCR技術(shù)在對(duì)蝦中的應(yīng)用初步研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2002，23(1)：1-4.

[4] 陳大鵬，沈懷舜，丁亞平，等.文蛤地理種群ISSR分子標(biāo)記的初步研究[J].南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，27(3)：74-77.

[5] 崔靈英，許 璞，朱建一，等. 4種紫菜葉狀體的ISSR分子標(biāo)記分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2006，13(3)：371-377.

[6] 李 莉，孫振興，楊樹德，等.用微衛(wèi)星標(biāo)記分析皺紋盤鮑群體的遺傳變異[J].遺傳，2006，28(12)：1549-1554.

[7] 李永明，趙玉琪.實(shí)用分子生物學(xué)方法手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998.21-23.

[8] 李東明，林 剛，鄭勁松，等.兩個(gè)不同江豚群體ISSR遺傳多樣性初步分析[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版)，2005，29(6)：546-550.

[9] 沈玉幫，李家樂，牟月軍.厚殼貽貝與貽貝遺傳漸滲的分子生物學(xué)鑒定[J].海洋漁業(yè)，2006，28(3)：195-200.

[10] 王廷華，景 強(qiáng).PCR理論與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2005.1-18.

[11] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第2版) [M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999.458-463.

(責(zé)任編輯 萬(wàn)景輝)