新城疫病毒ＨＮ基因片段原核表達重組質粒的構建

摘要：根據GenBank中發表的新城疫病毒F48E9基因序列設計引物，采用RT-PCR技術，成功獲得了該病毒HN基因中兩個不交叉的基因片段，長度分別為790bp和579bp。將這兩段基因分別克隆到pGEM-T vector中，經酶切鑒定和測序后克隆到原核表達載體pET-28a，PCR和酶切鑒定表明，克隆的兩個新城疫病毒基因片段已經正確地插入到了原核表達載體pET-28a之中。

關鍵詞：新城疫病毒；HN基因片段克隆；原核表達

中圖分類號：S852.65+9.5；Q785；Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0506-03

Construction of the Prokaryotic Expression Recombinant Plasmids Containing NDV Gene Fragments

ZHAO Yong-xu1，QIAO Xian-feng2，LIU Xi-mei2，HUA Wen-jun2，ZHOU Jing-rong2，ZHENG Xin-min2，ZHANG Miao-tao1

(1.College of Veterinary Medicine，Northwest AF University，Yangling 712100，Shanxi，China；

2. Institute of Veterinary and Animal Science，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Lab of Animal Embryo Molecular Breeding，Wuhan 430064，China)

Abstract：Using Primers which were designed according to the sequence of HN gene of NDV F48E9 strain，two cDNA fragments 579 bp and 790 bp in length，of HN gene were successfully amplified by RT-PCR，and they are 579 bp and 790 bp in length. These two amplified cDNA fragments were cloned into pGEM-T vector. The results of identification by restriction endonuclease and sequencing analysis showed that they were successfully inserted into the expression vector pET-28a.

Key words：NDV；HN gene clone；prokaryotic expression

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus))，為單股負鏈RNA病毒，基因組全長15 186 bp，包含6個基因，分別編碼6個主要的結構蛋白[1]。其中血凝素-神經氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)具有血凝性、神經氨酸酶活性及促融合活性，在NDV侵染過程中負責識別受體，介導病毒吸附于細胞膜上，并能與F蛋白相互作用，共同完成侵染過程[2-5]。HN蛋白的抗原性除由HN蛋白抗原位點區域決定外，還與HN蛋白的成熟及蛋白分子的空間構象有關[6]。 F48E9

株為NDV中國標準強毒株，本試驗選取的兩段基因基本上包含了HN蛋白的主要抗原位點，通過對HN基因中的兩個不交叉片段進行克隆和原核表達載體構建，為進一步研究HN蛋白的抗原性和制備單克隆抗體及診斷性抗原等打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、質粒及主要試劑

新城疫標準強毒株F48E9購自中國獸醫藥品監察所；SPF雞胚購自華中農業大學實驗動物中心；Escherichia coli DH5α、BL21(DE3)為本實驗室保存；pGEM-T載體連接試劑盒購自Promega公司；PET-28a(+)DNA為Novagen公司的產品。主要試劑有TRIZOL(Invitrogen公司)、質粒小量快速提取試劑盒(博大泰克)、玻奶回收試劑盒(Biostar公司)；M-MLV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶NotI、Xhol I、NcoI等均為Promega公司產品。引物合成及重組質粒測序均由Invitrogen公司完成。

1.2 NDV病毒F48E9株的增殖及總RNA的提取

將種毒按1∶1 000倍稀釋，接種9日齡SPF雞胚，37℃孵育24 h，收取尿囊液。按1∶3的比例加入Trizol試劑，按說明書操作提取病毒總RNA。

1.3 引物設計

參考GenBank中F48E9的HN基因序列，用軟件Pimer5.0設計兩對引物，用于擴增HN基因中兩段不交叉的核酸序列。其中引物F1、F2的跨度為790bp，位于HN基因的上游；引物F3、F4的跨度為579bp，位于HN基因的下游；RT為反轉錄引物。

F1：CCCTCGAGGACCTTGTAGGCATACTGA

F2：CATGCCATGGCCATAGACTGGGAACCAT

F3：CCCTCGAGATTCGGATGGCTAAGTCT

F4：CATGCCATGGTGCTGAGGCAATAGGTTT

RT：ATGGACCGTGTAGTTAGC

下劃線為Xhol I和Nco I的酶切位點及保護性堿基。

1.4 RT-PCR反應

使用設計的反轉錄引物，按Promega公司的M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄。RT反應條件為：75℃ 10 min，迅速冰浴5 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，加入RNase H，37℃ 20 min，65℃ 10 min滅活RNA酶。PCR反應總體積25 μL，其中上下游引物各2.5 μL、dNTP 4 μL、模板2 μL、Taq酶0.5 μL、10×反應緩沖液2.5 μL，滅菌去離子水補足25 μL。PCR反應程序為：94℃ 5 min預變性，94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環，最后72℃ 10 min。取PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，玻璃奶回收試劑盒回收PCR產物。

1.5 擴增產物的克隆和測序

回收片段與pGEM-T vector 連接后轉化感受態大腸桿菌 DH5α，涂布于含氨芐青霉素、X-gal，IPTG的LB培養板，37℃培養過夜，隨機挑取陽性菌落，加入LB培養基，搖菌后用試劑盒提取重組質粒，用Xhol I和Nco I做酶切鑒定，選取兩份初步鑒定正確的重組質粒送至Invitrogen公司進行序列測定。

1.6 目的片段插入表達載體

將上述測序正確的重組質粒和原核表達載體pET-28a分別用Xhol I和Nco I雙酶切，電泳后回收目的片段進行連接和轉化，篩選陽性菌落，重組表達質粒經酶切和PCR鑒定后轉化大腸肝菌BL21(DE3)，進行目的片段的表達。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR法擴增的兩個HN基因片段

利用設計的特異性引物對NDV F48E9株的核苷酸進行RT-PCR結果見圖1。由圖1可以看出，通過RT-PCR擴增出了579bp和790bp的目的條帶，與預期片段大小相符。

2.2 重組質粒pGEM-HN1和pGEM-HN2的克隆與鑒定

通過對陽性重組質粒的PCR鑒定，擴增出與目的片段大小一致的條帶；用Nco I和Xhol I雙酶切鑒定，結果切出的兩個條帶分別為579 bp，3 000 bp和790 bp，3 000 bp(圖2)。由圖2可以看出，重組質粒pGEM-HN1和pGEM-HN2經PCR擴增能擴增出目的條帶，經Nco I和Xhol I雙酶切后分別出現3 kb左右的pGEM-T載體和579 bp、790 bp的插入片段，而測序結果則進一步表明目的基因已經正確地插入到pGEM-T載體中；重組質粒的測序結果也表明已經成功地擴增到了目的片段，并且目的片段已經正確地插入到pGEM-T載體中。

重組質粒pGEM-HN1和pGEM-HN2的測序結果如下(其中橫線部分表示插入的目的片段)：

2.3 重組表達質粒pET-HN1和pET-HN2酶切鑒定

對重組質粒pET-HN1和pET-HN2進行了PCR和酶切鑒定，結果(圖3)PCR擴增出了579bp和790 bp的兩個目的條帶；Nco I和Xhol I雙酶切后分別出現5 kb左右的空載體和579 bp、790 bp的插入片段，表明目的片段已經正確地插入到了原核表達載體pET-28 a中。

3 小結與討論

研究表明，HN和F(融合)蛋白構成新城疫病毒囊膜外表面的纖突，是其功能性蛋白，在致病和免疫應答中起重要作用[7，8]，所以HN和F基因成為重組疫苗或基因工程疫苗的首選目的基因[9，10]。HN蛋白抗原位點利用單抗識別的表位在HN蛋白分子上勾畫出了球形頭部幾個獨立區域，3個區域193～201(位點23)、345～353(位點14，1)和第513～521殘基加上第494、569殘基(位點12，2)，位點14、1與12有部分重疊，位點12、2與位點23部分重疊，說明抗原位點的3個區域在分子表面上是集聚在一起的。而在自然結構中HN分子的抗原位點可能是由分子中非連續區域集聚在一起形成的[11，12]。本試驗選取的兩段基因基本上包含了HN蛋白的主要抗原位點，可以用其對HN蛋白的抗原性進行研究。由于pET-28a表達載體在起始密碼子之后有6個His(Tag)標記，因此下一步表達出的蛋白可以用Ni離子親和層析柱進行分離純化，純化后的蛋白可以進行免疫原性研究，以便用于制備診斷性抗原和單克隆抗體等。

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(責任編輯 王 珞)