牛乳素真核表達(dá)載體的構(gòu)建

摘要：以牛乳素為目的基因，構(gòu)建含有組氨酸標(biāo)簽、人生長激素信號肽的真核表達(dá)載體，為利用牛乳素在活體動物及培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)提供基因材料。用人工合成hGH-Lacf B的序列與T載體連接，用Xho I和BamH I酶切后與相應(yīng)酶切處理的pVAX1連接，取陽性克隆質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I酶切回收含hGH的pVAX1載體，再與經(jīng)過PCR擴(kuò)增的his-Lacf B連接，酶切鑒定及測序。DNA序列分析表明，攜帶hGH、6×his和目的基因Lacf B已成功連接到真核表達(dá)載體pVAX1中。

關(guān)鍵詞：牛乳素；組氨酸標(biāo)簽；人生長激素信號肽；真核表達(dá)

中圖分類號：Q513+.2；Q782；Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0501-02

Construction of the Eukaryotic Expression Vector Carrying Lactoferricin B

ZHANG Yu1，2，MA Feng-long2，LIU Huan-zhen2，QIAO Yan-liang2，ZHAO Yu-jun1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；

2.Shandong Sinder Technology Limited Company，Qingdao 266061，Shandong，China)

Abstract：To provide the eukaryotic expression vector carrying 6x histidine-tag and human growth hormone in expremental animal and cell culture，according to the published nucleotide sequence of the lactofericin B and human growth hormone，synthesis sequence was ligated with pMT-18 vector. The product was digested with Xho I and BamH I，and then cloned into the plasmid pVAX1.The recombinant plasmid was digested with EcoR I and Xho I，got the pVAX-hGH，and ligating with the gene encoding for his-lacfB and amplified using PCR technique. The eukaryotic expression vector carrying hGH、6x histidine-tag and lactofericin B had been established and verified by partial DNA sequence analysis.

Key words：lactoferricin B；histidine tag；human growth hormone；eukaryotic expression

乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)是一種分子量為70~80kD的糖蛋白，廣泛存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中[1]。Lf雖然具有抗菌活性，但酶解Lf得到的抗菌肽的抗菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Lf[2]。牛乳素(Lactoferricin Bovine，Lfcin B)是Lf在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用從N端釋放的一段由25個氨基酸殘基組成的小肽[3]。研究表明，Lfcin B具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作用，同時還具有抗病毒和腫瘤的作用[4]。從天然來源分離Lfcin B時，產(chǎn)量低、費(fèi)時長、工藝復(fù)雜、成本昂貴，而人工合成Lfcin B費(fèi)用更高，無法大規(guī)模生產(chǎn)。因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型抗菌肽-Lfcin B具有重要意義和極高的商業(yè)價值。本研究擬以人生長激素信號肽為前導(dǎo)序列、以牛乳素基因Lacf B為目的基因序列，構(gòu)建能在活體動物及培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行定位表達(dá)的真核表達(dá)載體。為了準(zhǔn)確地對真核表達(dá)載體構(gòu)建的合理性及表達(dá)效率進(jìn)行評價，我們引入了his-tag和hGH前導(dǎo)序列。該基因結(jié)構(gòu)為下一步在活體動物及培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)Escherichia coli DH5α，由本室制備；真核表達(dá)載體pVAX1，本實驗室保存。工具酶Xho I、EcoR I、BamH I和T₄ DNA連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品。細(xì)菌培養(yǎng)基所用的蛋白胨、酵母粉均為OXOID公司產(chǎn)品，瓊脂粉(日本)購自青島博維生物科技公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京天根生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 重組真核表達(dá)載體pVAX-hGH-Lacf B的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的編碼牛乳鐵蛋白肽(Lactoferricin B)25個氨基酸的mRNA序列，及人生長激素(hGH)的信號肽，合成hGH-Lacf B的全序列，共176bp。在5′端引入BamH I，hGH和Lacf B間插入EcoR I位點，在3′端引入Not I和Xho I酶切位點，與pMD18-T載體連接。用BamH I和Xho I雙酶切，取小片段插入相應(yīng)酶切處理的pVAX1，T₄ DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichia coli DH5α，完成重組載體構(gòu)建。

1.2.2 重組的真核表達(dá)載體pVAX-hGH-his-LacfB的構(gòu)建 以pVAX-hGH-Lacf B為模板，設(shè)計含有組氨酸標(biāo)簽的上下游引物，在上游、下游分別引入EcoR I、Xho I限制性酶切位點，擴(kuò)增his-Lacf B片段，并用RGS-his-Lacf B替換質(zhì)粒pVAX-hGH-Lacf B中的Lacf B，形成重組真核表達(dá)載體pVAX-hGH-his-Lacf B。引物序列如下：His-Lacf BU1：5′-GAATTCCATCACCATCACCATCACAAGTG

TAGAAGATGG-3’ 39bp；His-Lacf BD1：5′-CTCGAGGCGGCCGCTTAGAAAGCTCTTCTA-3′ 30bp；E-RGS-His：5′ACGAATTCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCAT 3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組的pVAX-hGH-Lacf B真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組的pVAX-hGH-Lacf B真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切后所得小片段，為176bp大小，與插入的片段大小相一致，并取菌樣送測序公司測序，結(jié)果均正確(圖2)。

2.2 重組的pVAX-hGH-his-Lacf B真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組的pVAX-hGH-his-Lacf B真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切后所得小片段，為127bp大小，與插入的片段大小相一致，菌樣送測序公司測序，結(jié)果正確(圖3)。

3 討論

Lfcin B是乳中一種重要的乳清蛋白，具有非常廣泛的功能，許多研究已經(jīng)證實Lfcin B在體內(nèi)具有抑菌及殺菌作用并參與許多免疫反應(yīng)[5]。奶牛乳房炎在奶牛業(yè)中是開支最為昂貴的一種疾病，主要由各種不同的病原菌引起。利用Lfcin B的抗菌、殺菌及調(diào)節(jié)免疫的作用，對于預(yù)防和治療奶牛乳房炎具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

本研究所選擇的載體pVAX1，是美國FDA認(rèn)可的應(yīng)用于核酸疫苗的表達(dá)載體，適合于DNA疫苗，便于短肽的表達(dá)。在載體構(gòu)建中，我們引入了人生長激素(hGH)前導(dǎo)信號肽和組氨酸標(biāo)簽(his-tag)。hGH是人腦垂體前葉分泌的一種蛋白質(zhì)激素，由191個氨基酸殘基組成，它的主要功能是促進(jìn)生長發(fā)育和維持組織器官的正常功能，增強(qiáng)細(xì)胞對氨基酸吸收和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，在此是為了促進(jìn)蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。his-tag的加入，為下一步表達(dá)蛋白的純化及鑒定打下了基礎(chǔ)。

本試驗成功地構(gòu)建了牛乳素的真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究牛乳素在真核細(xì)胞中的表達(dá)及其活性的測定打下了良好的基礎(chǔ)。目前本實驗室正在利用不同的轉(zhuǎn)染方法將真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-hGH-his-Lacf B轉(zhuǎn)入倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，檢測其在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)情況，已取得一些試驗結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1] BELLAMY W，TAKASE M，YAMAUCHI K，et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin[J]. Biochemet Biophy Acta，1992，1121：130-136.

[2] FENG X J，WANG J H. Fusion expression of bovine lactoferricin in Escherichia coli [J]. Protein Expression and Purification，2006，47：110-117.

[3] TOMITA M，BELLAMY W，TAKASE M，et al. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin [J]. J Dairy Sci，1991，74：4137-4142.

[4] WAKABAYASHI H，MATSUMOTO H，HASHIMOTO K，et al. N-Acylsted and D enantiomer derivatives of a nonamer core peptide of lactoferricin B showing improved antimicrobial activity[J]. J Antimicrob Agents Chemother，1999，43：1267-1269.

[5] SEYFERT H M，HENKE M，INTERTHAL H，et al. Defining candidate genes for mastitis resistance in cattle the role of lactoferrin and lysozyme[J]. J Animal Breeding Genetics，1996，113：269-276.

(責(zé)任編輯 王 珞)