亞麻ＣＡＤ基因克隆及序列分析

摘要：以亞麻(Linum usitatissimum L.)為材料，研究木質素代謝的關鍵酶亞麻肉桂醇脫氫酶基因序列。分離了高純度的RNA，以RNA為模板，用簡并引物以RT-PCR的方法，克隆了亞麻CAD基因cDNA部分序列，長度為477bp，編碼159個氨基酸殘基。此cDNA序列為亞麻CAD基因序列。

關鍵詞：亞麻；CAD基因；基因克隆；序列分析

中圖分類號：S563.2；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0496-02

Clone of Partial Sequence of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene in Flax

HUANG Hai-yan，WANG Yu-fu，XUE Zhao-dong，QIU Cai-sheng，HAO Dong-mei

(Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciencrs，Changsha 410205，China)

Abstract：The object of this study was to examine the sequence of flax CAD and investigate flax lignin biosynthesis pathway. High quality RNA was extracted from flax(Linum usitatissimum L.)and used as a template for cloning the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene cDNA by RT-PCR with degenerate primers under gradient temperature. Colonies with target foreign DNA inserts was identified by PCR. Recombinant pGEM-T plasmid was identified by restriction digestion and PCR，also sequence analysis. Flax cinnamyl alcohol dehydrogenase gene cDNA partial sequence was 477 bp long，coding 159 amino acids. The result of the domain analysis showed that the flax CAD was a member of the CAD family.

Key words：Linum usitatissimum；CAD gene；gene cloning；sequence analysis

木質素是植物體的主要化學組分，與纖維素、半纖維素共存于細胞壁中，填充于纖維構架中增強植物體的機械強度。植物木質素和纖維素的含量直接影響到植物生物產量、產品的質量和用途。肉桂醇脫氫酶(CAD)是催化木質素前體合成最后一步的酶，催化對香豆醛轉變為對香豆醇的反應[1]，因此通過降低或提高CAD活性，可減少或增加木質素的合成[2，3]。克隆CAD基因并研究其表達調控機理，可以為調控木質素的生物合成機理奠定基礎，具有重要的應用價值。本研究以亞麻為材料，通過RT-PCR技術克隆了亞麻CAD片段，為進一步克隆全長CAD基因和研究其表達特性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

亞麻(Linum usitatissimum L.)栽培品種Argo S。

1.2 方法

1.2.1 亞麻總RNA的提取 取田間生長旺盛的亞麻韌皮部組織約100 mg，按invitrogen的Plant RNA Isolation Regent說明書操作，提取總RNA。

1.2.2 亞麻CAD基因cDNA部分序列的克隆 通過GenBank聯機檢索，根據已報道的其他植物的CAD核酸序列的高保守區用Primer 5軟件設計了簡并引物，Forward Primer：5′-THG GHG GAG THG GNC ACA T-3′，Length：19 mer；Reverse Primer：5′-CVA CGA AYC TRT AHC KSA CAT C -3′，Length：22 mer。其中H=A、C、T；N=A、T、C、G；V=A、C、G；Y=C、T；R=A、G；K=G、T；S=C、G。

采用Superscript RT Kit(Tiangen)合成cDNA。PCR體系為50 μL，含RNase—Free ddH2O (33.5 μL)，10 x PCR buffer(5 μL)，2.5 mmol·L^-1 dNTP Mixture(5 μL)，10 μmol·L^-1Forward Primer I(2 μL)，10 μmol·L^-1 Reverse Primer I (2 μL)，cDNA (2 μL)，5 U·μL-1 TaKaRa Ex Taq HS 0.25 μL。

采用Biometra梯度PCR儀進行PCR，反應程序為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，46℃退火30 s，72℃延伸90 s共35循環，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物的克隆純化與篩選 將PCR產物采用TIANgel Midi Purification Kit (TIANGEN)進行切膠、回收、純化。連接到pGEM-T easy Vector (Promega)上。熱激法轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，并進行Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍白斑篩選。

選白色菌落做菌落PCR，將檢測為陽性的菌落進行液體培養，提取質粒DNA，并將重組質粒進行PCR檢測。以限制性核酸內切酶EcoR I酶切，檢測重組質粒插人目的片段情況。克隆產物送交上海英駿生物公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 亞麻總RNA的分離

RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結果(圖1)顯示，28S rRNA和18S rRNA共2條明顯的帶，從兩條帶的亮度判斷，RNA有較好的完整性；紫外分光光度法測得的A260/A230為1.6～1.9，表明RNA純度較高，符合進一步試驗要求。

2.2 PCR擴增目的片段

綜合考慮各影響因素得到最佳RT-PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，46℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35循環，72℃延伸10 min。RT-PCR擴增到的DNA片段大小約500 bp(圖2)。

2.3 亞麻CAD基因cDNA部分序列克隆與測序

將PCR的產物經電泳回收后經T載體連接后轉化到大腸桿菌DH5α中，通過Amp抗性和IPTG/X-gal藍白斑篩選。菌落PCR產物電泳檢測結果表明在陽性菌落中擴增到與RT-PCR擴增產物大小相同的DNA片段。重組pGEM-T質粒酶切結果表明，插人了與RT-PC R擴增產物大小相同的DNA片段。重組子質粒PCR檢測，進一步證明pGEM-T重組子質粒中插人了RT-PCR的產物(圖3)。

使用M13 primers將重組pGEM-T質粒進行測序，得到cDNA序列長度為477 bp，具體序列如下：

TAGGCGGAGT AGGACACATG GGAGTTAAGA TTTCCAAAGC

AATGGGACAC CATGTGACTG TAATTAGCTC CTCTGATAAG

AAAAAGGTTG AAGCACTGGA TCATCTCGGA GCTGATGAGT

ATTTGGTCAG TTCGGATTCG GCAACAATGG AACAAGCTGC

TGATTCGTTC GATTACATAA TCGACACTGT CCCTGTGAAC

CACCCGCTCG AGCCTTACCT ATCGCTGTTG AAGGTCGATG

GGAAGTTGAT CTTGATGGGT GTGATCAACA CCCCTCTTCA

GTTCATAAGT CCTATGGTGA TGCTAGGGAG GAAGGTGATA

ACAGGGAGCT TCATAGGGAG CATGAAGGAA ACAGAGGAGA

TGCTGGAGTT CTGCAAGGAT GAAGGGTTGA GCTCCATGAT

TGAGGTGGTG AAGATGGACT ATGTGAATAC GGCGTTCGAG

CGGCTAGAGA AGAATGATGT CCGTTACAGA TTCGTCG

此cDNA序列與GenBank/KKBJ/EMBL數據庫進行核苷酸同源性比較分析(BLASTN)，與GenBank登錄號為AF038561.1和X65631.1(分別是Eucalyptus globulus和E.gunniiCAD)的同源性達到78%和77%，表明此片段應為亞麻CAD基因片段。

3 討論

亞麻是我國的重要經濟作物，纖維中木質素含量達2%～8%，尤其云南及新疆種植的亞麻，其木質素含量高達10%以上。通過基因工程技術有目的地降低木質素的含量或改變其組分，改良亞麻品質，將是亞麻遺傳育種改良非常有前景的領域。木質素的存在對亞麻紡織性能和纖維品質有較大影響。本研究根據其他植物的CAD基因的保守區設計相應的簡并引物，利用RT-PCR技術克隆了亞麻CAD基因的477bp片段，為進一步獲得亞麻CAD全長基因并研究其表達特性及木質素合成的代謝調控打下了基礎。

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(責任編輯 鄭 威)