結構域Ｔｔ ＡＰｕＸ２１基因的分離與克隆研究

摘要：以熱產硫化氫高溫厭氧桿菌菌液為模板，根據Gene Bank中登記的編碼結構域Tt APuX21基因序列設計1對特異引物，利用多聚酶鏈反應技術，擴增出目的基因Tt apux21，并克隆到表達載體pET21a(+)中。經菌液PCR篩選和DNA測序鑒定，表達載體pET21a(+)中插入有序列正確的Tt apux21基因，重組質粒命名為pEX21。

關鍵詞：結構域；PCR擴增；克隆

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)05-0493-03

Study on Isolation and Cloning of the Gene Encoding Module Tt APuX21

XIE Wan-bin

(College of Chemistry and Bioengineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China)

Abstract：A pair of specific primers were designed according to the gene sequence encoding module Tt APuX21 adopted in Gene Bank. By the improved PCR amplification technology，interest gene Tt apux21 was obtained from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus，and then cloned into expression vector pET21a(+). Bacterial culture PCR showed that interest gene Tt apux21 had been inserted into pET21a(+)，and DNA sequencing revealed that the sequence of the inserted fragment was the same as that of Tt apux21 adopted in Gene Bank (accession number：M28471). The recombinant plasmid was designated as pEX21.

Key words：module；PCR amplification；cloning

能源短缺已成為世界范圍內普遍存在的問題，且隨著石油、天然氣等不可再生能源的消耗速度加快，能源短缺問題越來越嚴重。生物質能作為一種替代能源，資源豐富，具有廣闊的前景。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active enZYmes，CAZY)可將秸稈大分子纖維素等降解為葡萄糖[1-3]，進而轉化為乙醇，制成乙醇燃料，成為解決能源短缺問題的一種可行途徑。然而，天然的碳水化合物活性酶將秸稈大分子纖維素等降解為葡萄糖的活性不高。碳水化合物活性酶分子由催化結構域(Catalytic Module)和非催化的碳水化合物結合結構域(Carbohydrate Binding Module，CBM)組成，CBM對碳水化合物活性酶催化活性的發揮起著很重要的協同作用。CBM可以提高碳水化合物活性酶的催化活性。去除酶分子中的CBM顯著降低酶分子的活性，特別是當底物為不溶性多糖時，去除CBM后碳水化合物活性酶的活性下降更快。而通過基因操作將CBM與無CBM的碳水化合物活性酶連接在一起則可以顯著提高酶活性。這是因為CBM可以從兩個方面影響酶活性：①CBM可以直接作用于大分子纖維素等，使這些大分子的物理結構發生變化，可以提高酶分子的催化結構域的作用能力；②CBM可以將酶分子與其底物的距離拉近，并保持酶分子與底物的結合狀態，從而增加了酶分子作用底物的機會[4]。

至今，已報道碳水化合物活性酶中存在49個家族的CBM，每個家族至少有1個成員的功能已研究清楚，被證明這些CBM都能夠與碳水化合物相互作用，從而提高碳水化合物活性酶的催化活性。不同家族CBM的配基特異性(Ligand Specificity)和結合能力(Binding Capacity)各異[4]。但是，每個家族的CBM通常只是對一種多糖有顯著作用，而能夠結合多種多糖并能提高酶活性的CBM還需進一步研究。近來報道的基因組數據庫中的CBM新家族X21和X25等，含有這些新CBM的碳水化合物活性酶與秸稈內多種多糖的降解有關。因此，弄清楚這些未知功能CBM的配基特異性對于了解植物細胞壁復雜糖類的降解、生產高效的秸稈降解用碳水化合物活性酶具有重要的理論意義和應用價值。

Tt APuX21是CBM新家族X21的一個成員，由129個氨基酸殘基構成，是熱產硫化氫高溫厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)的直鏈淀粉-普魯蘭糖酶(Amylase-Pullulanase)中的1個未知功能結構域。本研究將利用現有的基因組數據庫，對Tt APuX21進行克隆表達，通過多糖微陣技術(Polysaccharide Microarray)和非變性親和電泳(Non-Denaturing Affinity Electrophoresis，NDAE)篩選其配基，以期發現具有新的配基特異性的新CBM，用來提高碳水化合物活性酶降解秸稈的活性，將秸稈大分子纖維素等高效地降解為葡萄糖，促進纖維素→葡萄糖→乙醇的轉化途徑的順利實現。目前已將編碼結構域Tt APuX21的基因分離出來，并克隆到表達載體pET21a(+)中，結構域Tt APuX21的誘導表達和功能分析正在進行中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Tuner、熱產硫化氫高溫厭氧桿菌和質粒pET21a(+)均由英國紐卡斯爾大學(University of Newcastle)Harry J. Gilbert教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq HS DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA 連接酶購自大連寶生物公司；DNA快速純化/回收試劑盒購自北京鼎國公司。

1.1.3 引物 根據編碼結構域Tt APuX21的基因Tt apux21，運用引物設計軟件primer premier 5.0設計引物。

上游引物(Pf)為：5′ CCGCATATGGGACCTGATAATAAC 3′，下劃線部分為NdeⅠ位點；

下游引物(Pr)為：5′ CACCTCGAGAGTAAGTT

CGAAGTC 3′，下劃線部分為XhoⅠ位點。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Tt apux21的PCR擴增 以熱產硫化氫高溫厭氧桿菌菌液為模板，用Ex Taq HS DNA polymerase對Tt apux21進行PCR擴增。PCR反應體系為：Pf(20 μmol·L^-1) 0.5 μL；Pr (20 μmol·L^-1) 0.5 μL；菌液0.2μL；10×PCR reaction buffer 2 μL；dNTP mixture(各2.5mmol·L^-1) 2μL；ddH2O 14.7 μL；Ex TaqDNA polymerase 0.1 μL。PCR反應條件為：94℃預變性300s[5]；然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環；最后72℃延伸300 s。PCR產物做1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

1.2.2 Tt apux21的克隆 用NdeⅠ和XhoⅠ分別雙酶切PCR產物及pET21a(+)表達載體，然后進行連接，并轉化進克隆宿主菌大腸桿菌DH5α感受態細胞中，具體操作方法參見文獻[6]。

1.2.3 陽性克隆的篩選 從轉化平板上挑單菌落，接種于5mL含Amp50 μg·mL-1的 LB液體培養基中，37℃，200rpm培養12 h左右。取1 μL上述培養液，做100×稀釋，制成菌液模板，按1.2.1款做菌液PCR。PCR產物做1%瓊脂糖凝膠電泳，若結果顯示有與Tt apux21大小一致的PCR產物，則可初步推斷該單菌落為陽性克隆。

1.2.4 陽性克隆的測序鑒定 取經菌液PCR篩選到的陽性克隆培養液850 μL、滅菌甘油150 μL，置于1.5 mL離心管中，混勻，送上海英駿生物技術有限公司，用通用引物T7 promoter primer對插入片段進行DNA測序鑒定。

1.2.5 重組質粒轉化Tuner 經過DNA測序鑒定正確后，將陽性克隆中的重組質粒命名為pEX21，并將pEX21轉化進表達宿主菌大腸桿菌Tuner感受態細胞中，以便進行后續的誘導表達和功能分析。

2 結果與討論

2.1 Tt apux21的PCR擴增

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：在250bp～500bp之間有一明顯擴增片段(圖1)，與預期的片段大小一致(根據引物的設計，預期的擴增片段長度為405bp)。

2.2 陽性克隆的篩選

分別將Tt apux21與pET21a(+)的連接產物和空質粒pET21a(+)轉化大腸桿菌DH5α，挑單菌落進行LB液體培養，然后做菌液PCR，結果顯示：連接產物的轉化菌在250bp～500bp之間有一明顯擴增片段，與Tt apux21大小一致(圖2第1泳道)，而空質粒pET21a(+)的轉化菌無此特異片段(圖2第2泳道，在此作為陰性對照)。

2.3 陽性克隆的測序鑒定

取經菌液PCR篩選到的陽性克隆培養液，送上海英駿生物技術有限公司，用通用引物T7 promoter primer對插入片段進行DNA測序鑒定，將測序結果(圖3)與Gene Bank中熱產硫化氫高溫厭氧桿菌(熱產硫化氫梭菌)的直鏈淀粉-普魯蘭糖酶基因的x21序列進行Blast比對分析。結果表明，所得的陽性克隆為載體pET21a(+)中插入有序列正確的Tt apux21片段，克隆成功。

參考文獻：

[1] HAZLEWOOD G P，GILBERT H J.Structure and function analysis of Pseudomonas plant cell wall hydrolases[J]. Prog Nucl Acid Res Mol Biol，1998，61：211-241.

[2] TOMME P，WARREN R A J，GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Adv Microb Physiol，1995，3：71-81.

[3] WARREN R A J.Microbial hydrolysis of polysaccharides[J]. Ann Rev Microbiol，1996，50：183-212.

[4] HENRISSAT B. CAZy website：http：//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/acc_CBM.html. 2008.

[5] 生秀杰，周偉強，姜 莉，等.應用以菌落為模板的聚合酶鏈反應技術篩選重組陽性克隆[J]. 中華檢驗醫學雜志，2002，25(4)：239-240.

[6] J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南(第3版)[M].北京：科學出版社，2002.

(責任編輯 昌炎新)