湖南漢族人群ＡＣＥ Ｉ／Ｄ基因多態性與冠心病血瘀證的遺傳流行病學研究

摘要：目的用單體型相對風險分析(HHRR)和連鎖不平衡檢驗(TDT)方法在冠心病(CHD)血瘀證家系中探討血管緊張素轉換酶(ACE)基因內含子16中的插入/缺失(I/D)多態是否為冠心病血瘀證的遺傳易患因素。方法2003年10月－2005年11月收集先征一級親屬中至少有1例冠心病病人的家系40個和健康人家系10個，屬CHD血瘀證家系組25個家系81例，其中核心家系18個共60例。PCR－RFLP方法鑒ACE基因I/D多態性基因座基因型。在對ACE基因多態與冠心病血瘀證基因存在關聯的基礎上進行HEIRR和TUF分析。結果CHD家系ACE基因的基因型、等位基因都沒有偏離Hardy－Wemberg平衡。在HHRR中，ACE的D基因與冠心病血瘀證無關聯(P＞0 05)；對15個滿足要求的核心家系進行T13T檢驗，雜合子父母傳遞給患病子代的D等位基因頻率未顯著偏離50％(P＞0.05)。結論在冠心病血瘀證家系中未發現ACE基因I/D多態與冠心病血瘀證存在關聯或與疾病基因座存在連鎖，說明該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易惠基因，而是冠心病血瘀證的發病危險因素之一。

關鍵詞：湖南漢族人群；冠心病；血瘀證；遺傳易患性；血管緊張素轉換酶基因；多態性

中圖分類號：R541.4 R256.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0787－03

冠心病(CHD)是一種多因素疾病，受環境和遺傳等多因素的影響，為有明顯遺傳傾向的多基因病。CHD的發生與發展與多種易患基因多態性有關，尤其與血管緊張素轉換酶(ACE)插入/缺失(I/D)基因多態性等密切相關。中醫理論認為冠心病基本病機為心脈瘀阻，血瘀證是CHD最常見的證型，那么ACE基因多態性是否為CHD血瘀證家系的遺傳分子生物學標志之一，值得深入研究。本研究就是在前期對ACE基因多態與冠心病基因存在群體關聯的研究基礎，利用核心家系資料進行單體型相對風險分析(HHRR)和連鎖不平衡檢驗(TDT)分析，檢驗該基因座是否與中國湖南漢族人群冠心病血瘀證基因存在連鎖。

1 資料與方法

1．1 研究對象2003年10月－2005年11月對長沙地區冠心病中醫證候臨床流行病學研究中符合WHO冠心病診斷標準的3116例冠心病病人，篩查冠心病家族史，對其中521例存活且愿意接受調查者進一步開展遺傳流行病學調查。冠心病血瘀證家系定義為．先證者為CHD血瘀證病人，其一級親屬(父母、同胞及子代)至少有1人為冠心病血瘀證病人。共收集先證者一級親屬中至少有1例冠心病血瘀證病人的家系40個和健康人家系10個，屬cHD血瘀證家系組25個家系81例，其中核心家系18個共60例。屬非CHD血瘀證家系組15個家系共50例，其中核心家系10個共32例。兩組核心家系共28個。

以符合1979年WHO制定的缺血性心臟病心絞痛、心肌梗死的診斷標準，以病人臨床癥狀、體征和病史，結合心電圖改變進行診斷。參照WHO多國心血管趨勢和決定因素監測(MONIA)研究方案設計冠心病調查表，詳細記錄每一病例的臨床表現、輔助檢查、生化結果及危險因素。

1．2 實驗方法采血前禁食12 h，于08:00空腹靜脈取血2 mL，以2％EDTANa抗凝。參照《分子克隆實驗指南》進行基因組DNA提取，PCR－RELP方法鑒定DNA基因型。引物：由上海生工合成。

1．3 統計學處理應用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，基因型、基因分布頻率比較采用X²檢驗，在核心家系中有關等位基因與疾病的遺傳關聯分析采用單體型相對風險及傳遞不平衡檢驗分析數據，用X²檢驗各率的分布差異。

1．3．1 HHRR統計核心家系中父母及子(女)的等位基因頻率獲得四格表，X²=2N(WZ-Xy)²/(W+X)(W+y)(X+Z)(y+Z)查表得出P，檢驗有統計學意義則有關聯，反之則無。

1．3．2 傳遞不平衡檢驗(TDT)TDT＝(b-c)²/(b+c)；此統計量近似符合自由度為1的X²分布。以b表示含有關聯等位的雜合子型親代傳遞該等位的例數，以c表示雜合子親代未傳遞該關聯等位的例數，用配對四格表McNemar檢驗作出獨立性判斷。

2 結 果

經ACE基因多態性分析表明，從28個核心家系中的CHD病人及雙親中共檢出2種等位基因，分別計算病例組和父母組的基因型和等位基因的數目和頻率分布。

2．1 ACE基因型在核心家系中分布的Hardy－Wemberg平衡檢驗無論是病人還是雙親的ACE基因型分布頻率觀測值與預計值差異都不顯著(雙親X＜sup>2＜/sup>=0.0896，病人X＜sup>2＜/sup>=0.317 2，P＞0.20)，均符合Hardy－Welnberg平衡。說明樣本來自一個較大的、處于隨機婚配平衡狀態的群體，具有一定代表性。

2．2 單體型相對風險分析對28個核心家系的資料采用基于單體型HHRR方法，計算出冠心病與ACE等位基因關聯性，其中在血瘀證家系中的ACE(2N)個等位基因中，16(w)個D基因發生傳遞，12(Y)個未傳遞；44個I基因中20(X)個發生傳遞，24(z)個未發生傳遞。經X＜sup>2＜/sup>檢驗，提示冠心病血瘀證與ACE的D基因多態性無關聯(P＞0.05)。

2．3 傳遞不平衡檢驗分析TDT法在于檢驗零假設(Q=1/2)，若拒絕該假設可認為兩位點連鎖。本組資料中符合TDT分析的血瘀證家系15個，等位基因D從雜合子父母向子代傳遞了10次，未傳遞5次，等位基因從雜合子父母向子代傳遞了5次，未傳遞10次。按X＜sup>2＜/sup>=(b-c)＜sup>2＜/sup>/(b+c)=1(P＞0.05)；結果提示，冠心病血瘀證易患位點可能與ACE的D等位基因位點不連鎖(P＞0.05)。

3 討 論

冠心病是威脅人類健康的重要疾病。流行病學調查、疾病監測和死因統計結果顯示，冠心病發病和死亡在世界范圍內仍呈上升趨勢。目前從微觀水平探討冠心病發病的遺傳易患機制是進行其病因研究的主要手段之一。而冠心病是一種復雜性的多基因疾病，更傾向于應用遺傳易患性和危險因素的概念。目前據流行病學調查、雙胞胎研究以及家系調查結果均表明冠心病有明顯的家族傾向。據遺傳流行病學研究顯示，冠心病一級親屬的發病危險較非冠心病者增加了2倍～10倍，冠心病存在家族聚集性，且親屬CHD發生越早，該個體罹患冠心病的危險越高。

以往通過對54例冠心病血瘀證先證者和54例健康人進行家系遺傳分析，提示子女患冠心病血瘀證與親代雙方患病有因果關系。冠心病血瘀證可能是一種具有遺傳傾向的“多基因證”。

中醫學認為，同一種疾病在不同個體多表現為不同的證型，現代遺傳學也認為臨床上呈現不同程度的異質性都是病人個體基因組結構和功能差異的反映。DNA多態性既可作為遺傳病病因，又可作為遺傳標記應用。中醫證候的臨床表現可能與疾病的易患基因多態性之間存在相關性，CHD血瘀證為冠心病常見證型，與脂質代謝紊亂、凝血機制的異常、血管內皮細胞的損傷有關。因此在易患基因定位研究中選擇何種方法至關重要，直接影響到能否發現易患位點。群體關聯分析、家系連鎖分析、家系關聯研究和傳遞不平衡檢驗這些疾病基因定位研究來探討ACE是否為CHD血瘀證遺傳易患基因是非常有必要的。

本研究在對ACE基因多態與冠心病血瘀證基因存在群體關聯的基礎上，應用HHRR和TDT分析方法來研究在冠心病血瘀證家系中，ACE基因多態與冠心病血瘀證是否存在關聯或與疾病基因座是否存在連鎖，結果發現在冠心病血瘀證家系中未發現ACE基因T/D多態與冠心病血瘀證存在關聯或與疾病基因座存在連鎖，說明該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因，而是冠心病血瘀證的發病危險因素之一。

本文編輯 王雅潔