丹紅注射液促血管新生作用及其量效關系的實驗研究

摘要：目的 探討丹紅注射液的促血管新生作用及其量效關系的可能機制。方法 分別以堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)與生理鹽水作為陽性及陰性對照，不同濃度丹紅注射液作用于雞胚絨毛尿囊膜(CAM)后計數一級、二級管，觀察其促血管新生作用。不同濃度丹紅注射液加入臍靜脈血管內皮細胞培養液(HUV)中，以ELISA方法檢測培養液中血管內皮生長因子(VEGF)的濃度差別。結果 不同濃度丹紅注射液的CAM一級及二級血管新生均較生理鹽水組增強，且有量效關系。丹紅注射液各組內皮培養液中VEGF濃度均高于生理鹽水組，也存在量效關系。結論丹紅注射液具有促CAM血管新生的作用且有量效關系，可能的機制為丹紅注射液具有促血管內皮分泌VEGF，作用也存在量效關系。

關鍵詞：血管新生；丹紅注射液；冠心病；血管內皮生長因子

中圖分類號：R541．4 R285．5

文獻標識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)06—0504—03

當前冠心病的血運重建術如冠狀動脈支架術及旁路移植術血管新生已普遍應用，效果肯定。但相當數量的病人冠狀動脈病變非常彌漫，有些病人無條件或不愿接受血運重建術，冠狀動脈的血管新生治療是極具吸引力的治療手段，已成為冠心病治療的熱點。現代醫學證實血管內皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)具有明確的促進血管新生的作用，已用于冠心病病人的血管新生基因治療研究，距臨床實用尚有較大距離。近年來研究顯示中醫藥在促血管新生領域前景廣闊，丹紅注射液治療冠心病療效確切，具有明確的活血化瘀通絡功效。為闡明丹紅注射液促血管新生作用的機制，本研究擬應用人臍靜脈內皮細胞培養實驗，觀察丹紅注射液促血管內皮細胞分泌VEGF的作用。

1材料與方法

1．1雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型的制備 白皮種蛋購自上海川沙旗桿種禽養殖場。參照賀國安等[1]的“無氣室孵育法”加以改進。種蛋在38．5℃60％烘箱中孵育6 d后(傾角45度轉蛋防止雞胚黏連，每天至少2次)用安爾碘、75％乙醇擦拭蛋殼氣室端“開窗”部位消毒。待干后，用無菌鉆孔器鉆取小孔，接著用無菌鑷擴大孔徑至1cm～1．5cm小窗，使開窗位置在CAM上方，用吸耳球吹凈氣室中卵殼碎屑，用1mL無菌注射器在氣室膜上滴加少許生理鹽水分離氣室膜和下層的CAM膜，隨后用無菌鑷將挑破的氣室膜分離，充分暴露CAM膜。取事先準備的直徑5mm的無菌載體置于CAM膜上兩條前卵黃靜脈之間相對無血管區，用微量移液器向載體上滴加藥物加樣。

1．2 CAM實驗藥液與載體的制備 丹紅注射液由濟南步長制藥有限公司提供，與臨床靜脈注射用生理鹽水按比例配置成1：1，1：2，1：4，l：8無菌液體，4℃下保存備用。陽性對照組用重組牛堿性成纖維細胞生長因子，珠海億勝生物制藥有限公司生產(商品名“貝復濟”)。載體用直徑為5mm的定性濾紙，118℃高壓蒸汽滅菌30min備用。所用苯扎溴銨、安爾碘、甲醇、丙酮、75％乙醇均為分析純試劑。

1．3 CAM模型分組及實驗過程 分別以生理鹽水、bFGF為陰性和陽性對照組，丹紅注射液與臨床靜脈注射用生理鹽水按比例配置成1：1，1：2，1：4，1：8無菌液體作為藥物治療組，每組樣本12個胚胎，每胚加樣量為10tLL，加樣后，以無菌封口膠封口，置入烘箱中繼續孵育。連續加藥3 d后制作CAM標本，揭開封口膠，每胚加入2．5 mL～5mL甲醇、丙酮等量混合固定液，室溫下固定10min，待CAM上血管內血液凝固后，祛除CAM膜水平以上蛋殼，以載體為中心剪下CAM膜，放人盛有少量清水的平皿中展開，平鋪于濾紙上陰干制成CAM標本。用無菌剪照相和掃描處理結果。以實驗部位邊緣1mm為范圍內一級血管，實驗部位邊緣5mm范圍內為二級血管，分別觀察計數，比較各組之間的差異。

1．4人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)實驗材料與載體的準備 人臍靜脈內皮細胞株購自上海午立生物技術有限公司，試劑盒由上海森雄科技實業有限公司提供，操作嚴格按說明書進行。用意大利西亞克公司的ALISAI酶免自動分析系統，按藥盒說明在792nm處測定A值。胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養液粉末購自美國GIBCO公司。所用其他化學試劑均為分析純試劑。丹紅注射液由濟南步長制藥有限公司提供，與臨床靜脈注射用生理鹽水按比例配置成1：4，1：8無菌液體，4℃下保存備用。

1．5細胞培養及VEGF測定 將購入的人臍靜脈內皮細胞株，用含10％胎牛血清、100U／mL青霉素、50 U／mL鏈霉素的1640培養液(采用0．22／μm微孔濾膜過濾除菌)在37．5℃、5％CO2濃度的培養箱中培養，每天更換培養液1次。傳代中用含0．25％胰蛋白酶、0．25％EDTA(乙二胺四乙酸)的消化液進行消化。以1：2，1：3比例分瓶傳代。取第4代～第6代活性較高的細胞進行實驗。培養的人臍靜脈內皮細胞以4×105個／孔接種于24孔培養板，第1天用含10％FBS的1640培養液，次日換成分別加有丹紅注射液和bFGF、生理鹽水40μL／孔的含10％FKS的1640培養液接著培養24h，實驗分為丹紅注射液原液組、1：4組、1：8組、陰性對照組(生理鹽水)、bFGF陽性對照組。每組9個樣本。第3天，吸取每孔中的上液，吸入Eppendorf管在4℃3 000 r／min條件下離心12min，取得上清液。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗法(ABC—ELISA)檢測細胞上二清液中VEGF水平。

1．6統計學處理 各組間差異比較用單因素方差分析中的多重比較q檢驗。

2結果

2.1 各濃度組丹紅注射液在CAM上的促血管生成作用①一級血管：1：1，1：2，1：4的丹紅注射液組的血管數較生理鹽水組明顯增加，血管分支增多(P<0.01)。1：8組的血管數和生理鹽水組血管數相比，差異無統計學意義(P>0．05)。丹紅注射液1：1，1：2，1：4各組與bFGF組比較無統計學意義。②二級血管：與一級血管的結果類似，1：1，1：2，1：4丹紅注射液濃度組的血管數較生理鹽水組明顯增加，血管分支增多(P<0.01)，1：8組的血管數量與生理鹽水對照組相比無統計學意義。1：8，l：4，1：2丹紅注射液濃度組與bFGF組比較無統計學意義。詳見表1。

2．2丹紅注射液對培養的人臍靜脈內皮細胞分泌VEGF的影響(見表2)丹紅注射液各組和bFGF組VEGF水平與生理鹽水組比較有統計學意義，1：8與1：4濃度組組間差異有統計學意義(P<0．05)，原液組與1：4組比較無統計學意義。

3討論

血管新生的病理生理較復雜，由促血管新生的因子與抑制血管新生的因子保持動態平衡，已知促進血管新生的因子主要有VEGF與bFGF等。大量研究表明，VEGF在體內和體外主要作用于血管內皮細胞，發揮促血管新生作用。VEGF促血管新生的主要機制包括：①VEGF高度特異性地作用于血管內皮細胞，誘導內皮細胞增殖、出芽、遷移和形成管腔；②VEGF在生理性血管新生(angiogenesis)和腫瘤的血管新生過程中可有效延長內皮細胞壽命，誘導內皮細胞表達抗凋亡蛋白；③VEGF可動員骨髓中的內皮祖細胞進入外周循環并定位到缺血組織，在原位分化形成內皮細胞成熟并形成新的血管，即血管發生(vas－culogenesis)。FGF同樣具有較強的促血管新生的作用，但由于可疑具有使血管平滑肌增生作用及較強的促血管硬化斑塊增生的作用，很少作為促血管新生以治療缺血的制劑，但常作為陽性對照試劑應用。國外的基因治療研究顯示，應用質粒或腺病毒作載體的方法將VEGF導入缺血性缺血的心肌組織，可以見到明顯的血管新生作用，心絞痛等缺血癥狀及心功能均有明顯好轉。雖然這些方法離臨床應用尚有距離，但說明治療性血管新生的思路是可行的、有效的。探討治療缺血性心臟病療效確切的具活血化瘀通絡功效的中藥制劑血管新生的作用具有重要的意義，不但有助于闡明其作用機制，更有利于在嚴重的缺血性心臟病人中推廣應用，以較低的代價、較好的效果造福于病人。

本研究應用成熟的CAM模型研究顯示，丹紅注射液具有明確的促血管新生作用，而且隨著紅花濃度的增加此作用在一定的劑量范圍內具有量效關系，量效關系存在也進一步證實紅花具有促血管新生作用。為了闡明紅花促血管新生可能的作用機制，進一步觀察了紅花對人臍靜脈內皮細胞分泌VEGF的作用。結果顯示紅花注射液具有明確的促內皮分泌VEGF的作用，而且在一定范圍內這種作用隨紅花濃度的升高增強，即存在一定的量效關系。丹紅促血管新生的作用機制可能與紅花具有促血管內皮分泌VEGF的作用有關。促血管內皮分泌VEGF的作用存在量效關系，紅花促血管新生的作用也必然存在量效關系。丹紅注射液用于治療缺血性心腦血管疾病勢必明顯改善心腦等組織的缺血，而顯示其良好的療效。

丹紅注射液具有明確的促血管新生作用且具有量效關系，作用機制可能是與其促血管內皮分泌VEGF并有一定的量效關系有關。