轉基因抗病毒病四倍體西瓜的培育

摘 要：利用西瓜花葉病毒2號(WMV-2)外殼蛋白(CP)基因、小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)復制酶(NIb)基因和黃瓜花葉病毒(CMV)復制酶基因構建三價基因的植物表達載體，通過農桿菌介導轉化四倍體西瓜植株，經分子檢測證明目的基因成功地導人西瓜植株，并在后代中穩定遺傳。經溫室及大田接種鑒定，T3代轉基因西瓜抗病毒性達中抗水平，為抗病毒無籽西瓜新品種的培育提供了可能性。

關鍵詞：四倍體西瓜；病毒病；轉基因；抗病性

病毒病是西瓜三大主要病害之一，在世界范圍內均有發生。我國所有的西瓜種植區域均不能幸免，常年發病面積達10萬hm²，年經濟損失達1.5億元。尤其在安徽、河南、河北、山東、山西、陜西等我國西瓜主產省區，病毒病的發生最為嚴重，且三倍體無籽西瓜病毒病的發生重于二倍體西瓜，目前尚無農藥能有效地進行防治，不少田塊因病毒病而絕收。因此，培育抗病毒病無籽西瓜新品種，是西瓜生產中亟待解決的問題。

1991—1997年，黃學森研究小組將WMV-2的CP基因導入西瓜植株，獲得抗性材料，并獲農業部批準，進行安全釋放試驗。2002年，王慧中等將WMV-2的CP轉入西瓜，獲得了抗WMV -2的純合系。西瓜在大田遭受多種病毒的侵害，其中主要有3種病毒：WMV-2，ZYMV，CMV。抗1種病毒的轉基因抗病材料不適合直接在生產中應用。美國As-grow種子公司，采用轉基因技術，曾將WMV-2、CMv、ZYMv這3種病毒的CP基因成功轉入西葫蘆植株，獲得了抗病毒病西葫蘆新品種，并已獲準上市。根據CP和復制酶基因介導的抗性特點，1998年以來，筆者將WMV-2CP基因、ZYMV復制酶基因、CMv復制酶基因構建成植物表達載體，通過農桿菌介導遺傳轉化二倍體西瓜植株。經分子檢測和抗病毒鑒定，篩選獲得的轉基因西瓜株系表現出較好的抗病性能，隨后筆者將三價外源基因轉入四倍體西瓜，也獲得了抗性植株。

1 材料與方法

1．1 材料

細菌菌株、質粒、寡核苷酸引物、植物表達載體的構建，與筆者培育轉基因抗病毒病二倍體西瓜相同。植物表達載體的構建策略圖見圖1：

1．2 西瓜外植體培養

基因受體為本單位自己培育的新四倍體單系H-8，用子葉作為外植體，四倍體與二倍體的子葉培養沒有本質區別，但四倍體的再生能力不如二倍體。其培養方法與黃學森等1994年，牛勝鳥、黃學森等2005年所做試驗相同，種子去殼，在0.1％升汞溶液中消毒8～10min，用無菌水沖洗3次，在1/2 MS培養基上培養，每20粒種子接種1瓶，16h光照，8h黑暗，光照度1500～2000lx，日光燈光源。培養溫度：光照時(26±1)℃，黑暗時(22±1)℃。切取5d左右苗齡的子葉，培養在M1培養基上，M1以MS為基礎，加入2，25m/L的6-BA，每瓶接種15片子葉。

1．3 西瓜植株的遺傳轉化

離體子葉在M1培養基上培養1周左右，在近軸端的葉脈處，出現微小的愈傷突起時與農桿菌共培養。將固體培養基上的菌落，刮到液態LB+Kan+Sm培養基中，在26～28℃下，培養12～19h，菌液OD₂₆₀約0.8時備用。子葉在菌液中浸泡5～8min，濾干多余菌液后放回M1培養基，1周后移入Ml+Kan100mz/L+Cb100mg/L的培養基上。以后每2周換1次同樣的培養基，1個月左右，愈傷突起發育成芽叢，將這些芽叢轉移到M2培養基上，M2培養基為MS+KT0.2 mG/L+Kan100 mG/L+Cb100mG.L。2周左右，幼芽伸長至2cm左右，切下幼芽，嫁接到砧木上，在人工氣候箱中煉苗，然后將植株轉入溫室生長、開花、結果。

1．4 外源基因的PCR檢測

小苗在溫室生長時，取約0.1g的葉片，按SDS-KAc方法，小量提取植株總DNA，分別用引物WMVS-1、WMVS-2，ZS-1、ZS-2，CMV-3、CMV-4進行PCR檢測，保留PCR陽性植株。

1．5 外源基因的Southern-blot檢測

按照SDS-KAc方法大量提取PCR陽性植株葉片的總DNA，Hind III酶切后Southern-Blot驗證。

1．6 抗病性鑒定

將當代陽性植株采集的種子T0代，在農業部農業生物基因工程安全委員會批準的試驗田中，繁殖第2代并獲種子T1，T1發育成的第3代植株分別在網室和試驗田進行病毒接種。網室內只安排部分單系的少數種子，在排除外來干擾的情況下，觀察接毒情況和病情發展。大田試驗的目的，主要是為了獲得抗病材料，行距為1.5m，株距10cm。 網室與大田的接毒方法相同。將WMV-2、ZYMV病葉，在0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中磨碎，稀釋10倍，于西瓜幼苗的3葉期磨擦接種，將病毒接種于2片真葉上。20d后第1次檢查發病情況，以后每隔1周對部分單系跟蹤調查。第1次檢查后，將大田中2級以上病株拔除，留下抗病株結瓜。

病情分級如下：

0級：無病：

1級：植株1/3葉片表現病毒病癥狀，但不影響生長：

2級：植株1/2葉片表現病毒病癥狀，輕度影響生長；

3級：2/3葉片表現病毒病癥狀，嚴重影響生長，不能坐瓜或果實失去商品性：

4級：2/3以上葉片表現病毒病癥狀，植株嚴重矮化枯萎或接近死亡，沒有產量：

0、1、2級，一般通稱抗病植株，3、4級通稱感病植株。

在網室內取部分抗病、感病植株，進行ELISA檢測，檢查病毒含量。抗病株自交，測定產量和果實可溶性固形物含量，觀察果實形狀，與原受體品種比較是否變異。采收種子。

2 結果與分析

2．1 外植體的轉化

四培體西瓜子葉分化胚狀體的百分率明顯低于二倍體，本品種在M1培養基上子葉分化率為15％左右。1kZ種子，播500瓶，切1000瓶子葉，在篩選培養基上成苗286株，再生率約為1.9％：轉入培養土，移入溫室，并收獲種子的為75株，最終再生率約為0.5％：經PCR-電泳檢測，陽性植株為23株，陽性率為31％。其再生率低于二倍體，陽性率與二倍體基本相同。

2．2 外源基因的PCR-Southern檢測

70代106個樣品中有25個樣品呈PCR陽性，陽性率占24％(圖2)。

2．3 外源基因的Dot-blot和Southern-blot檢測

在PCR檢測基礎上，用WMV-2CP基因為探針，進行了點雜交檢測，同時選取內源單拷貝基因(絲氨酸乙酰轉移酶)作上樣內參照(圖3)。從圖3可看出，用sat探針進行雜交，結果表明樣品之間總DNA上樣量差別不大，根據WMV-2CP探針的雜交結果可以初步認定轉基因植株1，2，3，4，5，7，9，10為陽性植株，基因組經HindⅢ酶切后而進行的Southern-blot檢測證明樣品7為陽性植株，這說明外源基因成功地轉入了西瓜植株(圖4)。

2．4 轉基因后代植株的抗病性鑒定

陽性植株的T2代421個單系約5800株，于3葉期人工接種WMV-2和ZYMV后，2周植株開始發病，接種后20d開始調查發病情況：非轉基因植株對照病情指數100，轉基因單系病情指數為20～100，病情指數20～50的占20％，50～80的占30％，80～100的占50％。

第2、3、4……次發病調查，原0、1級的植株不斷地變為3、4級，接種40d左右是病變高峰。個別病株，由原來的3、4級，逐漸緩和病情，長出趨向正常的葉片。到采收西瓜時，約有100株病級為0、1級。選取6株抗病性最好、農藝性狀也最好的單瓜繁殖下一代，再做抗病毒鑒測，病情指數為20～50，抗病毒性能良好。轉基因西瓜的農藝性狀與受體品種沒有差異。單株與單株有些不同，屬正常范圍。具體結果見表1。

BH-I的特性、特征：果實圓球形，綠色果皮覆墨綠齒條，外觀似京欣l號；紅瓤。脆質，中心可溶性固形物含量11.5％，邊部為8％，多汁爽口。植株生長穩健，除抗病毒病外，還高抗枯萎病。易坐瓜，第9節出現第1朵雌花，以后每隔6～8節再現雌花，中早熟品種，全生育期93d左右，開花至果實成熟31d。

為了檢測T3代轉基因植株的純合度及具體的抗感程度，選取15株抗病性好、農藝性狀也較好的T2代單瓜，在溫室種植繁殖下一代，每個單系種8株，3葉期人工接種ZYMV，同時釆葉片小量提取DNA進行PCR檢測以估計純合度。經PCR檢測，有3個單系的植株均為陽性，抗病性檢測結果見表2。

從表2可看出，121單系有2株高抗，2株恢復，4株感病；81單系有2株高抗，2株恢復，4株感病；83單系有2株高抗，4株恢復，1株延遲，1株感病；非轉基因對照3株均感病。同對照相比，3個單系均有植株達到高抗甚至免疫水平，其中83單系有1/2的植株表現為恢復，只有1株為感病。

3 結論和討論

本試驗將WMV-2外殼蛋白基因、ZYMV復制酶基因、CMV復制酶基因，成功導人西瓜植株，轉基因植株對瓜類作物主要病毒有明顯抗性，有的植株甚至達到免疫，這在西瓜生產上有很高的利用價值。

在對T3代植株的檢測過程發現，單系內PCR檢測均為陽性的植株間抗性表現仍不完全一致，推測T3代的外源基因還存在分離。單系間抗性表現也有差異，可能是外源基因的插入位置不同所引起。這些還需進一步的實驗證實。

在對TO代植株的檢測中，PCR陽性植株點雜交也為陽性，根據內源探針的雜交結果可排除外源基因點雜交的假陽性，但酶切Southern雜交陽性率卻很低，具體原因尚不清楚，也許是TO代植株葉片中攜帶有農桿菌，造成了點雜陽性的假象，或者是提取的基因組DNA含糖量太高，影響了Southern雜交結果。

在接種試驗中，ZYMV毒源為中國分離物，而用來轉化的ZYMV復制酶基因來源于新加坡分離物，2種分離物在轉化的復制酶基因區域只有83％的序列同源性，根據復制酶介導的抗性特點——株系特異性，有些單系抗性較弱可能是由于接種的病毒株系所致。

在抗病毒篩選中，接種病毒液中病毒顆粒的濃度很難量化，接種傷口的大小很難十分一致，兩者都會影響發病的速度和程度，有待于找出最理想的方法。

作者簡介：黃學森，男，研究員，主要從事西瓜育種及生物技術研究。