西葫蘆根腐病病原的鑒定

摘 要：通過對所采集的西葫蘆根腐病病株進行分離培養(yǎng)，共得到5種病原菌，分屬于疫霉菌Phytophthora和鐮刀菌Fusarium2個屬。經(jīng)致病性測定，確定引起西葫蘆根腐病的主要致病菌為疫霉菌，鐮刀菌對西葫蘆根腐病的發(fā)生有加重作用。經(jīng)鑒定該致病疫霉菌為煙草疫霉菌(Phytophthorantcotaicte)，主要致病鐮刀菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporam)。

關(guān)鍵詞：西葫蘆根腐病；病原鑒定；煙草疫霉菌；尖孢鐮刀菌

西葫蘆根腐病也被人們稱為萎蔫病、爛秧病等，是近幾年普遍發(fā)生在山西省日光溫室內(nèi)新生的一種根部病害。該病多從始花期開始發(fā)生，危害植株根部，造成根部皮層腐爛，上部莖葉萎蔫死亡，嚴重地塊發(fā)病率之高在70％～90％，成為影響和制約保護地西葫蘆種植與發(fā)展的重要問題。國內(nèi)外報道的能夠引起西葫蘆根腐病的病原主要有茄病鐮孢菌，辣椒疫霉菌、甜瓜疫霉菌和煙草疫霉菌等，那么引起山西省西葫蘆根腐病的病原究竟是何，還未見報道。現(xiàn)將筆者采集病集株進行分離培養(yǎng)、致病性測定和病原菌鑒定的結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1．1 供試材料

1．1．1 供試病株 供試病株于2004年采于山西省長子縣、交城縣和榆次市三地發(fā)生西葫蘆根腐病的越冬茬西葫蘆溫室中。

1．1．2 供試西葫蘆品種 越冬茬西葫蘆品種為冬玉，由長子縣綠榮農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1．1．3 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為黑麥培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、米飯培養(yǎng)基、PL培養(yǎng)基、Bilay’s培養(yǎng)基和Czaek培養(yǎng)基。

選擇性培養(yǎng)基：在胡蘿卜基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入利福平20mg/L、氨卞青霉素200mg/L、制霉菌素100mg/L。

1．2 試驗方法

1．2．1 分離物的分離和純化 病株采用組織分離法。鐮刀菌(Fusariupd采用稀釋純化法，培養(yǎng)基為PDA平板培養(yǎng)基。疫霉菌(PhTtophthora)采用藥劑純化法，培養(yǎng)基為選擇性平板培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基。

1．2．2 分離物的致病性測定

1．2．2．1 幼苗培養(yǎng) 將滅菌砂與壤土按1:1混合裝于滅菌的9cmxgcm塑料杯中，澆透水，將種子用0.3％高錳酸鉀液消毒15min，洗凈，浸種催芽后播于杯內(nèi)，上覆滅菌土1cm。每杯1粒，出苗后備用。

1．2．2．2 接種體準備 疫霉菌接種物準備：任選1株疫霉菌菌株，活化后接種在胡蘿卜培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)10d，再挑取菌絲于無菌水中，在10～14℃下放置30min，使其產(chǎn)生游動孢子，待形成大量的休止孢后，將其稀釋成300個/mL左右的孢子懸浮液，以備接種使用。

鐮刀菌接種物準備：將純化的PDA平板上的鐮刀菌培養(yǎng)5d，切成0.2cm見方的小塊，移入500mL三角瓶的PL培養(yǎng)液中，25℃、120次/min振蕩培養(yǎng)7d，用雙層紗布濾后，濾液用3000r/min離心15min，棄上清液，將沉淀部分加入一定量的無菌水，充分攪拌后，制成1×10⁶的孢子懸浮液，以備接種使用。

1．2．2．3 單菌株接種 疫霉菌接種采用下胚軸接種法和蘸根接種法，鐮刀菌采用蘸根接種法。下胚軸接種法：在幼苗莖基部子葉節(jié)下1am處刺取深度為莖粗1/3的傷口，將在胡蘿卜培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d的疫霉菌的菌絲切成邊長2mm的方塊，接種在傷口處，以傷莖不接種作為對照，在20℃左右用滅菌脫脂棉蘸無菌水保濕24h，定期觀察病情。每處理10株，設(shè)3次重復(fù)。蘸根接種法：即將根系蘸孢子懸浮液，以無菌水作對照，在24～32℃下定期觀察病情。每次處理10株，設(shè)3次重復(fù)。

1．2．2．4 混合菌株接種 采用蘸根接種法，處理1先接種疫霉菌，24h后再接種鐮刀菌，對照12次都接種疫霉菌；處理2先接種鐮刀菌，24h后再接種疫霉菌，對照22次都接種鐮刀菌。定期記載發(fā)病情況。

1．2．2．5 病原菌再分離 對接種發(fā)病植株在實驗室再分離，方法同1．2．1。

1．1．3 病原菌的形態(tài)描述與鑒定 疫霉菌參考鄭小波對疫霉菌的鑒定方法。觀察胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長情況：將胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌絲小塊移入到盛有滅菌自來水的培養(yǎng)皿中，25℃條件下培養(yǎng)1～2d，觀察孢子囊的形態(tài)特征：挑取產(chǎn)生孢子囊的菌絲塊于試管中，加水1mL，用力搖晃5min，觀察孢子囊的脫落情況：在胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基上與標準菌株配對培養(yǎng)2～3周，檢查有性器官產(chǎn)生情況。

鐮刀菌參考Booth分類系統(tǒng)進行鑒定，在Booth標準條件下，將純化后的菌株接種于PSA培養(yǎng)基上，在25℃、每天12h日光燈照射條件下培養(yǎng)，4d后測定菌落直徑并計算生長速度，10d后觀察培養(yǎng)性狀和產(chǎn)孢情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 病原菌分離結(jié)果

2004年12月上旬，從長子、交城和榆次三地各選取根腐病病株4株，共12株，分別在黑麥培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)。從表1結(jié)果可知：12株病樣分離出26個分離物，分離率為100％，初步鑒定為疫霉菌屬(Phytophthora，簡稱P)和鐮刀菌屬(Fusarium，簡稱F，4種分離物分別用F1、F2、F3、P4表示)，其中9株分離到疫霉菌，分離率為75％，標記為Pycl、Pyc2、Pyc3、PJcl、Pjc2、Pzzl、Pzz2、Pzz3、Pzz4；17株分離到鐮刀菌，標記為鐮刀菌Flycl、Flyc4、Fljc2、F1jc4、Flzzl、Flzz3、F2yc3、F2jcl、F2Jc3、F3yc4、F3jc3、F3ic4、F3zz4、F4yc4、P4jcl、F4zz3、F4zz4；有7株同時分離到疫霉菌和鐮刀菌，P與F1、F2、F3、P4在同1病株中的分離率分別為33.3％、16.67％、8.33％、25％。

2．2 分離物的致病性測定

分離物接種試驗結(jié)果如表2所示：用疫霉菌接種于西葫蘆幼苗下胚根，可使西葫蘆發(fā)病，呈現(xiàn)典型的根腐狀，從病株可再分離得到和接種菌相同的病原菌。鐮刀菌醮根接種西葫蘆幼苗，4個菌種中只有Flycl有較高的致病性，病狀為典型枯萎病狀，從病株中再分離也得到Flycl病原菌，其余的F2yc3、F3yc4、F4yc4 3個菌種無致病性或致病性較弱。以上結(jié)果說明疫霉菌是引起日光溫室西葫蘆根腐病的主要致病菌。

疫霉菌與致病鐮刀菌互作關(guān)系試驗結(jié)果如表3所示：先接種疫霉菌后再接種致病鐮刀菌、先接種致病鐮刀菌后再接種疫霉菌的平均發(fā)病率都顯著高于2次只接種疫霉菌、致病鐮刀菌的發(fā)病率，可以看出致病鐮刀菌與疫霉菌對西葫蘆根腐病的發(fā)生有一定的累加效應(yīng)。

2．3 病原菌的形態(tài)描述與鑒定

疫霉菌在胡蘿卜培養(yǎng)基上菌落呈棉絮狀，氣生菌絲較茂盛，基生菌絲扭曲，粗細不均，有時呈珊瑚狀；厚垣孢子不多見。球形，大小為23.6～33.1μm(27.2μm)；孢囊梗不分枝或簡單合軸分枝；孢子囊近球形、卵形，基部鈍圓，大小為30.4～50.1μm×19.5～34.1μm(36.8×25.9μm)，長寬比值平均為1.42，乳突明顯，高3.1～5.2μm(4.2μm)，孢子囊頂生，常不對稱，具脫落性，孢囊柄短，長約0.6～4.7μm(3.1μm)，排孢孔寬4.2～7.1μm(5.1μm)；藏卵器球形。壁光滑，直徑21.4～28.5μm(26.1μm)，卵孢子球形，滿器，直徑16.8～23.6μm(21.5μm)；雄器圍生，近球形，大小為10.2～14.4μm×8.4～12.8μm(12.8×11.6μm)；孢子囊在條件適合時可釋放8～22個游動孢子，游動孢子為橢圓形、圓形或腎形：異宗配合：菌絲生長最高溫度36℃。根據(jù)鄭小波疫霉菌分類系統(tǒng)，該疫霉菌鑒定為煙草疫霉(P.nicotianae)。見圖1～3。

鐮刀菌菌株Flycl在Booth標準條件下培養(yǎng)，其氣生菌絲絨狀，潔白豐厚，在PSA培養(yǎng)基上生長4d的菌落直徑為3.1cm，產(chǎn)孢細胞短，單瓶梗；培養(yǎng)物紫色：小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形，大小4.2～11.1μm×2.5～3.4μm；大型分生孢子組型美麗，月芽形，稍彎，向兩端比較均勻變尖，一般3～5隔，多數(shù)為3隔，大小12.3～37μm×3.0～6.0μm；厚垣孢子多球形，直徑為9.4～13.5μm，間生或頂生；未見有性階段。根據(jù)Booth鐮刀菌分類系統(tǒng)，該鐮刀菌鑒定為尖孢鐮刀菌(F. oxYsporurn)。其他3種鐮刀菌本試驗未做進一步鑒定。

3 結(jié)論與討論

通過對不同地點采集的西葫蘆根腐病病株的病原物進行分離、致病試驗和鑒定，結(jié)果表明：引起山西省西葫蘆根腐病的主要原物菌為疫霉菌屬(Phy-tophthora)的煙草疫霉菌(p.nicotianaer)和鐮刀菌屬(Fusarium)的尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，其中煙草疫霉菌(p.nicotianaer)是主要病原菌。國內(nèi)外涉及西葫蘆根腐病的報道較少，僅見1999年Hossain有過西葫蘆對煙草疫霉菌高度敏感的報道。

試驗中分離得到1種疫霉菌和4種鐮刀菌，本試驗對不同的分離物進行了單菌株接種，其中疫霉菌和尖刀鐮孢菌對西葫蘆有致病性且致病性較強，而疫霉菌接種表現(xiàn)典型的根腐病癥狀，尖刀鐮孢菌接種表現(xiàn)出典型的枯萎病癥狀。通過進行2種致病菌的致病關(guān)系試驗，證明尖孢鐮刀菌能加重根腐病的發(fā)生，這2種病菌的互作機理以及其他3種鐮刀菌是否也和根腐病的發(fā)生有聯(lián)系，還需進一步試驗。

文獻報道，侵染瓜類的疫霉屬的真菌有許多種，如甜瓜疫霉菌(P.melonis)、辣椒疫霉菌(P.capsici)、煙草疫霉菌(P.nicotianaer)和隱地疫霉菌(P.cryptogea)等。本試驗證明，煙草疫霉菌(P.nicotianaer)是山西省發(fā)生日光溫室西葫蘆根腐病的主要致病菌，這可能與地域和環(huán)境等因素有關(guān)，關(guān)于煙草疫霉菌在日光溫室內(nèi)的生活史、侵染規(guī)律以及侵染機制有待更進一步的研究。

作者簡介：郭尚，男，碩士，助理研究員，主要從事瓜類育種和栽培研究。