梓醇改善東莨菪堿誘導的學習記憶障礙及機制研究

王紅利，薛莉君，萬 東，祝慧鳳，徐曉玉

(1.西南大學藥學院暨中醫藥學院，重慶 400715;2.重慶市藥效評價工程技術中心，重慶 400715;3.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400016)

梓醇是滋陰補髓中藥地黃的主要活性成分之一，具有神經保護、抗炎、利尿、降血糖、抗癌、以及抗肝炎病毒等藥理作用［1-2］。前期研究發現梓醇具有明顯的腦保護效應，促進中風大鼠神經功能恢復，促進軸突生長蛋白GAP43表達［3］，有利于缺血性中風后神經血管結構和功能的重塑［4］。課題組在觀察梓醇對中風大鼠神經行為學功能的影響，用殘肢抓取食物的實驗時發現:食物所放位置是相對固定的［5］，梓醇治療組中風大鼠最先找到食物。基于以上的實驗發現，本實驗通過腹腔注射丁溴東莨菪堿復制記憶障礙模型［6］，選用 Morris 水迷宮［7-8］來測試梓醇對東莨菪堿所致學習記憶障礙的影響，并采用ELISA定量檢測大腦ACh和BDNF的含量，以期闡明其可能的作用機制，為梓醇治療中風、記憶障礙等相關疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物與分組昆明種小鼠70只，♀♂各半，體質量22～28 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心(合格證號:檢動字2002A040)。經訓練3 d，篩選出逃避潛伏期無差異小鼠56只，選取40只，♀♂各半，隨機分為4組:正常組、模型組(東莨菪堿，2 mg·kg-1)、奧拉西坦組(陽性藥物、105 mg·kg-1)和梓醇治療組(9 mg·kg-1)，每組10只。

1.2藥物和試劑梓醇(購自石家莊流波百鳥生物技術有限公司)，奧拉西坦(廣東世信藥業有限公司，規格5 ml:1.0 g，批號1001024)，丁溴東莨菪堿(購自海南雙成藥業有限公司，規格20 mg，批號20090211)，ACh(CK-E20536M)和 BDNF(CKE20084M)含量ELISA試劑盒均購自美國Rapidbio(RB)公司。

1.3主要儀器Morris水迷宮儀(成都泰盟科技有限公司)，EL-204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，H1650-W臺式微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，722型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，550型全自動酶標儀(美國BioRad公司)。

1.4藥物干預70小鼠連續3 d進行Morris水迷宮訓練與測試，淘汰逃避潛伏期有明顯差異的小鼠后，從中選取40只隨機分為4組(n=10):正常組、模型組(丁溴東莨菪堿)、奧拉西坦組(105 mg·kg-1)、梓醇治療組(9 mg·kg-1)。所用藥物均用生理鹽水稀釋，給藥劑量換算為10 ml·kg-1，均采用尾靜脈注射給藥，除模型組注射生理鹽水外，其余兩組分別同時注射奧拉西坦105 mg·kg-1，梓醇9 mg·kg-1，每日1 次，連續 3 d。

1.5水迷宮記憶訓練與測試測試之前，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射丁溴東莨菪堿，造成小鼠記憶障礙模型［6］，然后進行水迷宮測試。Morris水迷宮由圓形水池和自動錄像及分析系統兩部分組成。圓形水池(直徑80 cm，高30 cm)加水后用黑墨水滴成黑色使水不透明，且將迷宮均分為4個象限，水溫保持在25℃左右。另有一個黑色圓形平臺(直徑10 cm，高28 cm)，置于某一個象限中央，位于水面下1～2 cm左右。測試時，選擇象限作為入水點，將小鼠面向池壁放入水中，根據水迷宮跟蹤系統記錄動物尋找并爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期(escape latency)，120 s內未找到平臺則將動物引至平臺，逃避潛伏期記為120 s。實驗進行3 d，每只小鼠每天訓練4次(包括4個象限入水點)，且將小鼠引至平臺后在平臺上停留10 s。

1.6ELISA檢測腦ACh和BDNF含量水迷宮測試結束后，將各組小鼠快速斷頭取腦，于冰盤上分離大腦皮質和海馬，精確稱重，將皮質與海馬用生理鹽水按 1 ∶9 比例制成冰浴勻漿［10］，4 000 r·min-1，4℃離心10 min，取上清液作為待測樣品備用。按照ELISA試劑盒說明書實驗步驟測定ACh和BDNF含量。

1.7統計學處理數據采用±s表示，采用SPSS11.0統計軟件進行分析。各組間逃避潛伏期采用方差分析。

2 結果

2.1梓醇改善東莨菪堿誘導的記憶障礙Morris水迷宮實驗結果，與正常組相比，各組使用2 mg·kg-1東莨菪堿后，小鼠的潛伏期明顯延長(104.85± 32.13vs88.9 ± 21.47，P＜0.05)，表明 2 mg·kg-1東莨菪堿成功復制小鼠學習記憶障礙;經藥物治療后，梓醇組和奧拉西坦組均明顯縮短小鼠的逃避潛伏期(104.85±32.13vs73.12 ±21.13vs87.24±25.35，P＜0.05)，但與正常組比較差異無顯著性(P＞0.05);梓醇組與奧拉西坦組比較，小鼠的逃避潛伏期差異無顯著性(P＞0.05)。實驗結果如Fig 1。

2.2梓醇對小鼠大腦(皮質與海馬)腦源性神經元營養因子(BDNF)和乙酰膽堿(ACh)水平的影響與模型組相比，梓醇組小鼠大腦皮質和海馬BDNF含量明顯增加(304.12±49.01vs230.1±35.76，P＜0.01);梓醇組小鼠大腦皮質和海馬ACh含量明顯增加(570 ±59.18vs446.6 ±32.18，P＜0.01)。梓醇組和奧拉西坦組小鼠大腦皮質和海馬BDNF及ACh含量均超過正常組，梓醇組和奧拉西坦組ACh含量和BDNF含量組間比較差異無顯著性(P＞0.05)，表明梓醇與奧拉西坦具有相似的改善學習記憶機制。

Fig1 Effects of catalpol on escape latency in amnesia mice evaluated by Morris water maze test

Fig 2 Effects of catalpol on ACh and BDNF of hippocampus and cortex in amnesia mice induced by scopolamine

2.3BDNF和ACh相關性分析如 Fig 3，BDNF與ACh的含量可能有相關性(r=0.61，P＜0.05)，表明梓醇有改善丁溴東莨菪堿誘導的學習和記憶機能障礙，其促進BDNF的表達與膽堿能系統尤其是ACh含量相關，BDNF與ACh有密切的聯系。

3 討論

學習記憶能力的優劣直接影響很多疾病的康復過程。中風、癡呆等老年疾病常常伴有學習記憶能力的下降。中風后患者學習記憶能力的增強有利于患者語言、肢體精細感覺運動的學習和功能恢復，同時癡呆患者學習記憶能力的改善也明顯提高患者生活質量，因此尋找到既能有利于中風等疾病的治療，同時又能夠促進學習記憶的有效藥物，將是醫藥學界一大幸事。

Fig 3 Correlation between ACh and BDNF(r=0.61，P ＜0.05)

學習和記憶機制涉及復雜的神經生理和生化機制，尤其是膽堿能系統與學習記憶關系密切［9-10］。大腦有諸多機制用于記憶存儲，而ACh水平是這一過程的關鍵因素［11］。研究表明腦部釋放的神經遞質——ACh的多少決定了記憶的細節程度［11］。高水平的ACh能幫助大腦記憶更多細節。梓醇提高大腦皮質和海馬ACh含量，至少表明梓醇改善學習記憶影響了乙酰膽堿能系統，梓醇提高腦ACh濃度可能有利于細節記憶，將對記憶類疾病的治療帶來影響。

腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養因子家族中的重要成員，富集于大腦皮質和海馬等區域，也是記憶形成過程中的關鍵蛋白之一。越來越多的研究證實:BDNF是在記憶形成過程中的關鍵蛋白［12-14］。老年疾病如老年性癡呆癥與帕金森綜合癥［15-16］，患者大腦皮質海馬BDNF蛋白質及其受體TrkB的合成和分泌均明顯減少。研究表明BDNF及其受體參與海馬學習記憶的過程:①BDNF通過基底前腦膽堿能系統調節學習記憶:BDNF可以通過其受體Trk-B促進ACh的釋放，同時受PKC信號通路的調控［17-20］，參與神經突觸可塑性調節，影響學習記憶過程;②BDNF通過調節突觸傳遞易化長時程增強(LTP)。而且一定劑量的BDNF有助于克服恐懼，消除痛苦記憶［15-16］，將有助于疾病如中風后良性記憶的恢復，對心理的良性作用是不言而喻的。本研究結果表明梓醇促進大腦皮質和海馬BDNF的分泌，可能會通過其受體TrkB調節ACh合成、分泌和釋放，從而改善學習記憶障礙小鼠學習記憶能力。從BDNF與ACh兩參數相關性分析結果看，梓醇促進BDNF與ACh分泌具有較為明顯的相關性，更進一步證實了上述推測。

目前的文獻支持梓醇是一種神經血管單元保護劑，不僅治療中風疾病［4，21］，而且對于多種老年疾病［22-24］、神經退行性疾病都具有治療潛能，因此具有重要的研究和開發價值。本研究初步證實了梓醇提高了學習記憶障礙模型小鼠大腦ACh和BDNF的濃度，且二者具有良好的相關性，但梓醇影響ACh合成、分泌、代謝通路的具體環節還不清楚，這將是課題組下一步探討的課題。

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