增生性瘢痕形成過程中P53蛋白的增殖調控作用

魯峰 高建華 黎小間

魯峰高建華黎小間魯峰，男，1975年出生，第一軍醫大學97級碩士研究生，從師南方醫院整形外科高建華教授從事病理性瘢痕病因學研究，發表論文近10篇。

摘要目的：從成纖維細胞增殖調控水平，探討增生性瘢痕過度增長的細胞生物學機理。方法：取正常皮膚和增生性瘢痕各６例為標本，通過細胞培養6～10代后,應用流式細胞儀、粘附式細胞儀檢測不同來源的成纖維細胞、P53蛋白的表達和細胞周期的分布。結果:正常皮膚成纖維細胞主要分布在靜止期(G0、G1期)且P53蛋白的表達較高;增生性瘢痕成纖維細胞p53蛋白的表達較低,大量細胞處于增殖狀態(G2期、S期和M期)。結論:成纖維細胞細胞周期的分布及P53蛋白表達的差異可能是導致增生性瘢痕有別于正常皮膚呈現過度增生生長的細胞生物學機理之一。

關鍵詞增生性瘢痕P53細胞周期

THE DISTRBUTION OF CELL CYCLE AND EXPRESSION OF P53 PROTIEN

ON FIBROLASTS DERIVED FRON THE HYPERTROPHIC SCARS AND NORMAL SKINS

Lu Feng,Gao jianhua,Li Xiaojian

Department of Plastic Surgery,Nanfang Hospital of the First Military Medical University (Guangzhou 510515)

Abstractpurpose:To explore the conctete machanism which account for the different growth characterists of the normal skins and hypertrophic scars.Methods:Six samples of normal skins and hypertrophic scars were collected.The means of cell culture was used,and only 6-10 passages fibroblasts were selected for experiment.The distributions of cell cycle and expression of protein P53 were analysed with the help of the flow cytometer and adherent cell analysis and sorting interactive laser coytometer(ACAS 570).Result:Alarge percent of fibroblasts derived from the hypertrophic scars distribute in G2、S and M periods with low levels of the P53 protein.On the other hand,fibroblasts derived from the normal skins distribute mostly in G0 and G1 period with a high expression of P53 protein.Conclusion:The difference of the distributions of cell cycle and expression of protein P53 may account for the propagative growth characteristic in the pathlogical scars and normal skins.

Key wordsHypertrophic scarP53Cellcycle

瘢痕增生是組織創傷后的異常修復,是美容醫學基礎研究的重要課題。其具體形成機制至今不完全清楚。其組織學特點是病變部位膠原的過度沉積及成纖維細胞的聚集⁽¹⁾。成纖維細胞是病理性瘢痕形成的功能性細胞,過度增殖的成纖維細胞和沉積的膠原導致局部瘢痕組織明顯增生⁽²⁾。サ賈虜±硇擇：鄢上宋細胞過度增生的主要原因可能是增殖-凋亡調控的失衡。那么,這種異常的增殖-凋亡又是由哪些基因來調控的呢?目前仍缺乏這方面的研究。本研究試圖通過分析不同來源成纖維細胞的細胞周期分布及主要周期調控基因P53的表達,旨在從增殖調控水平初步探討導致病理性瘢痕形成的細胞生物學機理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1本實驗所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方醫院整形外科手術患者,均經臨床及病理診斷證實。增生性瘢痕患者6例,男4例,女2例,病變部位分別位于足背、面部及肘部;年齡20歲～35歲;同時取增生性瘢痕患者供皮區正常皮膚為對照。

1.1.2培養基P53單克隆抗體為美國santa cruze公司產品,胎牛血清為美國Hyclone公司產品,DMEM培養基(Dulbeccos modified minimal essential medium,美國GIBCO生產)碘化丙啶(propidium odide,PI)熒光染料為美國Sigma公司產品。

1.2方法

1.2.1成纖維細胞的培養將手術切下的正常皮膚、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織在無菌條件下切除其表皮,在少量胎牛血清中將標本切成1mm.3左右的組織塊置于培養瓶中,在95%空氣,5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下培養6小時～8小時,使組織塊牢固地粘附在瓶壁上,然后加入含15%胎牛血清的DMEM培養基適量,繼續培養,3天～4天換液1次,2周～3周后,原代細胞生長成單層,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1∶3的比例傳代培養,此后每2天～3天換液1次,每4天～5天分種傳代1次,實驗用第6代～10代細胞。

1.2.2流式細胞儀檢測增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細胞細胞周期的分布ト「粘ぢ瓶壁的細胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集于離心管中,1000rpm離心5min。PBS洗二遍,以70%冰乙醇固定細胞12小時以上,PBS離心沉淀去除固定液,加入500μl PI染液(含PI100μg/ml、Pnase 1mg/ml),37℃閉光孵育30分鐘,在Coulter EPICS Elite(ESP)流式細胞儀上進行細胞DNA含量測定并分析細胞周期的分布。

1.2.3流式細胞儀檢測增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細胞內P53蛋白的表達ト「粘ぢ瓶壁的細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后加入離心管內,1000轉離心5min。PBS清洗后4%多聚甲醛固定30分鐘以上。4℃2500轉離心5min,PBS洗兩遍,1%兔血清封閉非特異性抗原5min。PBS洗后,加入P53單抗50μl,4℃下過夜。PBS清洗后加入FTTC標記羊抗鼠的二抗。37℃水浴1h,PBS清洗兩遍,200目篩孔過篩,應用Coulter EPICS Elite ESP流式細胞儀檢測。

1.2.4粘附式細胞儀檢測增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細胞內P53蛋白的表達ト「粘ぢ瓶壁的細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養基,吹打后按每皿含細胞1×10.5的密度接種到petri培養皿中,在95%空氣,5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下孵育8小時～10小時,使細胞完全貼壁并伸展呈梭形。將培養皿取出,室溫下PBS液漂洗3次,4%多聚甲醛固定5-7min,PBS液漂洗3次后加入P53單抗20μe,37℃孵育30minPBS液漂洗3次后加入FITC標記的羊抗鼠的二抗,室溫孵育30min,PBS液漂洗3次,加入少許PBS液后待檢。ソ含已染色細胞的培養皿置于ACAS570交互式激光細胞儀(abherent cell analysis and sorting interactive lasercoytometer美國Meridian公司)載物臺,直觀地掃描測定細胞內染料初始熒光強度,得到細胞圖象。選擇待檢測細胞,測定各細胞內熒光強度。熒光強度值代表所選單個細胞內抗原的含量。

1.2.5統計學分析ニ得數據用均數±標準差表示,統計處理應用SPSS軟件,采用t檢驗進行比較分析。(附表)

2.結果

2.1流式細胞儀細胞周期分析結果顯示:正常皮膚成纖維細胞主要分布在靜止期(G0、G1期),處于增殖期的細胞占細胞總數的28%;增生性瘢痕成纖維細胞多數細胞處于增殖狀態(G2期、S期和M期),處于增殖期的細胞占細胞總數的70%,兩者之間差距顯著(P<0.01)從周期分布的規律我們可以看出正常皮膚和增生性瘢部成纖維細胞的增殖能力和生長狀況是有差別的。(圖1～2)。

圖1正常皮膚成纖維細胞細胞周期分布

顯示:瘢痕疙瘩中央部成纖維細胞主要分布于靜止期(G0+G1期),處于增殖期細胞百分率為30.0%。

圖2增生性瘢痕成纖維細胞細胞周期分布

顯示:瘢痕疙瘩周邊部成纖維細胞大多數分布于增殖期(G2+S+M期),占細胞總數67%。

2.2正常皮膚成纖維細胞P53蛋白的陽性表達率較高為70%,增生性瘢痕成纖維細胞的陽性表達率很低僅為17%(圖3～4)。兩組間差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖3正常皮膚纖維細胞P53蛋白的分布

顯示:正常皮膚成纖維細胞P53蛋白陽性表達率很高,為71.0%

圖4增生性瘢痕成纖維細胞P53蛋白的分布

顯示:增生性瘢痕成纖維細胞P53蛋白陽性表達率很低,為17.0%

2.3粘附式細胞儀實驗結果與流式細胞儀檢測結果吻合,P53蛋白陽性強度正常皮膚單個成纖維細胞較高而增生性瘢痕單個成纖維細胞較低(圖5～6)。可見,正常皮膚和增生性瘢痕成纖維細胞增殖能力和生長狀況的差別可能是由不同表達強度的P53基因調控的結果。

圖5正常皮膚單個成纖維細胞P53蛋白表達強度

粘附式細胞儀掃描圖顯示:正常皮膚單個成纖維細胞P53蛋白的熒光強度主要分布在2200左右。P53蛋白表達強度最強。

圖6增生性瘢痕單個成纖維細胞P53蛋白表達強度

粘附式細胞儀掃描圖顯示:增生性瘢痕單個成纖維細胞P53蛋白的熒光強度主要分布在1000左右。P53蛋白表達強度最弱。

3.討論ケ疚奈我們系列研究項目"病理性瘢痕成纖維細胞Fas介導的死亡信號的實驗研究"之VI。細胞周期的分布可以直觀地反應細胞群體的增殖狀況,因此我們選擇細胞周期作為觀測指標對不同部位成纖維細胞增殖能力進行分析。ビτ昧魘較赴儀定量分析細胞周期的分布是近年來一項新的細胞學技術,能快速、準確地研究任何類型細胞的周期分布的規律.⁽³⁾。增殖期細胞內存在活躍的DNA的合成,因此胞內DNA含量大于兩倍體細胞。此類細胞群包括G2期、S期和M期細胞。非增殖期細胞一般處于G1、G0期,因胞內DNA未復制,因此為典型的兩倍體細胞群。因此,應用pI染料標記細胞內DNA后,流式細胞儀可對每個細胞內的DNA進行記錄分析。結果經過統計后,可以見到兩倍體的G1峰、四倍體的G2峰及兩者間的S期細胞。經過電腦分析就可以了解一個細胞群體中增殖期及靜止期細胞的百分率。ケ臼笛檠芯勘礱,正常皮膚成纖維細胞主要分布在靜止期;增生性瘢痕成纖維細胞多數處于增殖狀態;從周期分布的規律我們可以看出正常皮膚及增生性顏痕成纖維細胞的增殖能力和生長狀況是有差別的,這也可以解釋增生性瘢痕過度增殖的原因。P53基因是參與細胞增殖調節的重要基因之一。在凋亡調控過程中也起著重要作用,它包括野生型和突變型兩種不同的存在形式^(4,5)。關于P53蛋白在調控細胞增殖機理方面的研究證實.^(6,7):P53蛋白能阻斷細胞從G1進入S期,使細胞停滯在G1期,從而抑制細胞的增殖過程。當P53蛋白含量減少或基因突變后,細胞可大量進入S期,分裂增殖加劇,從而導致增殖-凋亡的失衡。ケ臼笛檠芯糠⑾,P53蛋白陽性強度正常皮膚成纖維細胞內較高,而增生性瘢痕成纖維細胞內較低。此結果與細胞周期分布結果吻合,說明在瘢痕疙瘩形成過程中,P53蛋白的調控是細胞增殖調控最重要的方式之一。P53蛋白表達的減少,導致細胞大量進入增殖期,導致細胞增殖-凋亡的失衡。ビ泄豍53蛋白在增生性瘢痕形成過程中參與增殖調控的具體模式如何?增生性瘢痕形成過程中還有哪些基因參與了它的增殖調控?是否可將P53基因導入進行增生瘢痕的基因治療呢?研究的進一步深入必將有助于我們從一個新的角度來認識病理性瘢痕成纖維細胞增殖-凋亡失衡的機制,從而為最終揭開病理性瘢痕形成奧秘奠定理論基礎。參考文獻

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