miR-23a通過調(diào)節(jié)PPP2R5E促進(jìn)人舌鱗癌細(xì)胞的增殖

陶亞東, 柳 雪, 孫繼紅, 霍 峰, 郭洪杰

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院， 河北 承德 067000)

口腔癌是世界上最常見的第十一種惡性腫瘤，尤其是在發(fā)展中國家，在發(fā)病總數(shù)中排名第九[1]。在口腔癌中舌鱗癌最常見，舌鱗癌惡性程度高，生長速度快，浸潤性較強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移，是口腔癌部位發(fā)生率最高的[2]。近幾十年來，舌鱗癌的發(fā)病原因逐步明確，預(yù)防措施以及臨床診療技術(shù)也不斷發(fā)展，但舌鱗癌的五年生存率一直停滯在50%左右。多種miRNAs在舌鱗癌中表達(dá)失調(diào)，并與舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系[3]。例如，miR-24和miR-184在舌鱗癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展；miR-22和miR-137在舌鱗癌中表達(dá)降低，抑制舌鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。在舌鱗癌細(xì)胞中提高miR-23a的表達(dá)水平可以促進(jìn)順鉑引起的凋亡[5]。本課題將探討在舌鱗癌組織中異常高表達(dá)的miR-23a及其靶基因PPP2R5E對舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象和主要試劑:舌鱗癌組織由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科收集提供。舌鱗癌細(xì)胞系CAL27、兔抗人PPP2R5E和GAPDH多克隆抗體均購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、RIPA裂解液、BCA試劑盒以及各種細(xì)胞培養(yǎng)所需耗材均購自鄭州森輝生物科技有限公司。美國GIBCO公司的胎牛血清。美國invitrogen公司的Trizol和Lipofectamine 3000。RT-PCR試劑購自北京TakaRa公司。反義寡核苷酸購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。舌鱗癌細(xì)胞Tca8113系和實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒都由天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)CAL27細(xì)胞。用Lipo3000將質(zhì)粒和對照載體轉(zhuǎn)入Tca8113細(xì)胞中。

1.2.2RNA抽提:每份組織樣品，加入1mL的TRIZOL試劑。樣品勻漿后室溫下孵育5min，然后加入0.2mL的氯仿。劇烈振蕩15s，室溫孵育3min。4℃離心15min，轉(zhuǎn)速12,000r/min。沉淀RNA將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。每管加入0.5mL異丙醇。混勻后室溫靜置10min后，然后4℃ 12,000 r/min離心10 min。棄去上清液，4℃冷藏的75%乙醇每管加1 mL。RNA沉淀在空氣中自然晾干，約10min。每管加入20μL無RNA酶溶解10min。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3合成cDNA:配制體系:總RNA,0.8 μg;0.5ug/ul Oligo(dT),1μL;dNTPs Mix(2.5mM),1.6μL;無RNA酶的H2O，11.1μL； 總體積14.5 μL。65℃水浴5min, 冰上放置2min。瞬離后，在離心管中依次加入RT反應(yīng)液:5×First-Strand Buffer,4μL;0.1 M DTT, 1μL; RNase Inhibitor, 0.3μL; SuperScript III RT,0.2μL。混勻后37℃ 1min，50℃ 60min，70℃ 15min。cDNA產(chǎn)物置于冰盒中待用，或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn):按照所需用量增加配比體積。配置比例如下：2 × Master Mix，5μL；10uM 的PCR特異引物F，0.5μL；10μM的PCR特異引物R，0.5μL水，2μL(引物序列詳見表1)。加樣 取8ul混合液分別加入至每個(gè)孔中，再按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)的cDNA，2μL /孔；封膜，混勻，瞬離；置于冰板上備用。設(shè)置如下反應(yīng)程序：95℃，8min； 95℃，10s；60℃，60s；42個(gè)循環(huán)。計(jì)算結(jié)果:收集結(jié)果，采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。Folds=2-△△Ct，△△Ct=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)。

表1 引物序列

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育18h后收獲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。處理數(shù)據(jù)前，觀察并去掉異常值，計(jì)算均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6集落形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后消化重懸，進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔300個(gè)細(xì)胞種于12孔板上，各設(shè)置3個(gè)副孔。每3d換一次培養(yǎng)液，12d后對包含超過50個(gè)細(xì)胞的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。用結(jié)晶紫染色集落，以集落形成率來分析結(jié)果。

1.2.7生長曲線實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后24h收獲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔3000個(gè)細(xì)胞種于12孔板上，各設(shè)置3個(gè)副孔。每3d換一次培養(yǎng)液，每天同一時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7d。記錄計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制生長曲線。

1.2.8熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):通過MiRbase和Targetscan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測，miR-23a可以結(jié)合到PPP2R5E 3'UTR，結(jié)合位點(diǎn)序列為：AATGTGA,將該序列突變?yōu)門AAGAGT。將包含結(jié)合位點(diǎn)長度為150bp的野生型和突變型PPP2R5E 3'UTR(PPP2R5E 3'UTR, PPP2R5E 3'UTR mut)構(gòu)建到pCD3/EGFP載體中。以50nmoL/L ASO-NC,ASO-23a,或者200ng pcDNA3,pri-miR-23a和PPP2R5E 3'UTR, PPP2R5E 3'UTR mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)24孔板中的Tca8113細(xì)胞，使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 4h后換液；轉(zhuǎn)染48h后，RIPA裂解細(xì)胞，收獲蛋白，測定熒光值。

2 結(jié) 果

2.1miR-23a在舌鱗癌組織中的表達(dá):在10對舌鱗癌組織中應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-23a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在舌鱗癌組織中miR-23a的平均表達(dá)水平是相應(yīng)癌旁組織的4.617倍。miR-23a在舌鱗癌組織中表達(dá)異常升高(P<0.01)，見圖1。

圖1 舌鱗癌組織中miR-23a的相對表達(dá)水平

2.2miR-23a可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖:在舌鱗癌細(xì)胞中，我們過表達(dá)或封閉miR-23a的表達(dá)，分別應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和生長曲線實(shí)驗(yàn)檢測miR-23a對舌鱗癌細(xì)胞活性、集落形成能力和增殖能力的影響。在Tca8113細(xì)胞中，改變miR-23a的表達(dá)水平，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測轉(zhuǎn)染時(shí)、轉(zhuǎn)染后24h，48h和72h的吸光光度值。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-23a后，舌鱗癌細(xì)胞的活性明顯增強(qiáng)；封閉miR-23a的表達(dá)后，舌鱗癌細(xì)胞的活性明顯減弱(圖2A)。與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113和CAL-27中，過表達(dá)miR-23a后，舌鱗癌細(xì)胞的集落形成率明顯升高；封閉miR-23a的表達(dá)后，舌鱗癌細(xì)胞集落形成率明顯降低(圖2B和2D)。在Tca8113細(xì)胞中，改變miR-23a的表達(dá)水平，在一周內(nèi)每天計(jì)數(shù)細(xì)胞的增長，過表達(dá)miR-23a后細(xì)胞，細(xì)胞增長明顯加快；而封閉miR-23a后，細(xì)胞增長明顯降低(圖2C)。綜上，miR-23a可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

圖2 miR-23a促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖

(A)MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-23a對Tca8113細(xì)胞活性的影響；(B)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-23a舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113和CAL27中過表達(dá)或封閉對細(xì)胞集落形成能力的影響；(C)生長曲線實(shí)驗(yàn)檢測miR-23a對Tca8113細(xì)胞增殖能力的影響；(D)細(xì)胞集落形成的結(jié)晶紫染色結(jié)果。PCDNA3組是過表達(dá)組的對照，pri-miR-23a組是miR-23a過表達(dá)組；ASO-NC是miR-23a封閉組的對照，ASO-23a組是miR-23a封閉組。

2.3PPP2R5E是miR-23a的直接靶基因:通過TargetScan，miRBase等生物信息學(xué)網(wǎng)站PPP2R5E是miR-23a的潛在靶基因，miR-23a與PPP2R5E 3'UTR有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，如圖3、圖4所示我們應(yīng)用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在Tca8113細(xì)胞中，miR-23a的種子序列可以直接與PPP2R5E mRNA的3'UTR結(jié)合并抑制下游基因表達(dá)。在舌鱗癌細(xì)胞系中， miR-23a可以負(fù)性調(diào)控內(nèi)源性PPP2R5E mRNA的表達(dá)。

圖3 miR-23a與PPP2R5E 3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)信息

圖4 PPP2R5E是miR-23a的直接靶基因且受miR-23a的負(fù)性調(diào)控

(A)miR-23a對野生型PPP2R5E 3'UTR熒光素酶的影響EGFP組為單獨(dú)(B)miR-23a對突變型PPP2R5E 3'UTR熒光素酶的影響(C)miR-23a對 PPP2R5E mRNA水平的影響

分組設(shè)計(jì)：EGFP組為單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3-EGFP，PPP2R5E 3'UTR組單獨(dú)轉(zhuǎn)染了pcDNA3-EGFP-PPP2R5E 3'UTR質(zhì)粒，其他四組是共轉(zhuǎn)染組，共同轉(zhuǎn)染了pcDNA3-EGFP-PPP2R5E 3'UTR質(zhì)粒以及如下四種： PCDNA3組是過表達(dá)組的對照，pri-miR-23a組是miR-23a過表達(dá)組；ASO-NC是miR-23a封閉組的對照，ASO-23a組是miR-23a封閉組。

單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3-EGFP-PPP2R5E 3'UTR質(zhì)粒比單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3-EGFP的EGFP熒光表達(dá)強(qiáng)度低，由于Tca8113細(xì)胞中含有內(nèi)源性miR-23a，與PPP2R5E 3'UTR結(jié)合抑制了下游的EGFP蛋白表達(dá)。將pcDNA3/EGFP-PPP2R5E 3'UTR與pcDNA3，pcDNA3-pri-miR-23a共轉(zhuǎn)染后，pri-miR-23a組熒光表達(dá)強(qiáng)度比pcDNA3組明顯降低，內(nèi)源性miR-23a與PPP2R5E3'UTR結(jié)合抑制了下游EGFP蛋白表達(dá)，綠色熒光強(qiáng)度降低； PPP2R5E 3'UTR質(zhì)粒與miR-23a的反義互補(bǔ)序列ASO-23a及對照組ASO-NC共轉(zhuǎn)染，ASO-23a組的EGFP熒光強(qiáng)度明顯高于ASO-NC組，表明內(nèi)源性miR-23a被ASO-23a封閉后，不能與PPP2R5E 3'UTR相結(jié)合，解除對下游EGFP蛋白表達(dá)的抑制，熒光強(qiáng)度升高(圖4A)。

對PPP2R5E 3'UTR中的miR-23a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pcDNA3/EGFP-PPP2R5E 3'UTR mut質(zhì)粒。將PPP2R5E 3'UTR mut質(zhì)粒分別與pcDNA3, pcDNA3-pri-miR-23a, ASO-23a及對照組ASO-NC共同轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，其熒光表達(dá)強(qiáng)度沒有明顯變化，表明PPP2R5E 3'UTR的 “種子序列”突變后，miR-23a不能再與PPP2R5E3'UTR結(jié)合，也不能抑制EGFP蛋白的表達(dá)，熒光強(qiáng)度沒有變化(圖4B)。

在Tca8113細(xì)胞中改變miR-23a的表達(dá)水平，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測PPP2R5E mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-23a后，PPP2R5E mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)；而封閉miR-23a后，PPP2R5E mRNA的表達(dá)水平明顯升高(圖4C)。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

綜上，miR-23a能夠與PPP2R5E 3'UTR的結(jié)合，降低下游PPP2R5E mRNA的表達(dá)水平，由此證明 PPP2R5E是miR-23a的直接作用靶基因。

2.4PPP2R5E在舌鱗癌組織中的差異表達(dá)。

在10對舌鱗癌組織中，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測PPP2R5E mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在舌鱗癌組織中PPP2R5E mRNA的平均表達(dá)水平為0.582，而在相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)水平為1.119。舌鱗癌組織中PPP2R5E的表達(dá)降低至0.582，P=0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PPP2R5E在舌鱗癌組織中表達(dá)異常降低(圖5)。

圖5 在舌鱗癌組織中PPP2R5E的表達(dá)水平

2.5PPP2R5E抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

我們在舌鱗癌細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-PPP2R5E和pSilencer/sh-PPP2R5E及其空載體pcDNA3和pSilencer，改變舌鱗癌細(xì)胞中PPP2R5E mRNA的表達(dá)，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和生長曲線實(shí)驗(yàn)檢測其對舌鱗癌細(xì)胞活性，集落形成能力和增殖能力的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)PPP2R5E后，細(xì)胞的吸光光度值較對照組明顯降低，即細(xì)胞活性減弱；而干擾PPP2R5E的表達(dá)后，細(xì)胞的吸光光度值較對照組明顯升高，即細(xì)胞活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A)。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾PPP2R5E的表達(dá)后，細(xì)胞集落數(shù)較對照組明顯升高，即細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng)；而過表達(dá)PPP2R5E后，細(xì)胞細(xì)胞集落數(shù)較對照組明顯降低，即細(xì)胞集落形成能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6B和6D)。生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)PPP2R5E后，細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少；而干擾PPP2R5E的表達(dá)后，細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6C)。綜上，過表達(dá)PPP2R5E可以抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖，而干擾PPP2R5E的表達(dá)可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖。PPP2R5E基因可抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖，在舌鱗癌中起抑癌基因作用。

圖6 PPP2R5E抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖

(A)PPP2R5E對Tca8113細(xì)胞活性的影響(B)PPP2R5E對Tca8113和CAL-27細(xì)胞集落形成能力的影響(C)PPP2R5E對Tca8113和CAL-27細(xì)胞生長能力的影響(D)Tca8113細(xì)胞集落形成的結(jié)晶紫染色圖片。pcDNA3組是過表達(dá)的對照組，PPP2R5E為過表達(dá)pcDNA3/HA-PPP2R5E的組，pSilencer是敲降組的對照，sh-PPP2R5E組是轉(zhuǎn)染pSilencer/sh-PPP2R5E的敲降組。

3 討 論

在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)miR-23a表達(dá)異常升高，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-23a在胰腺癌中表達(dá)升高，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]。在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中miR-23a表達(dá)升高，并通過靶定PDK4促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[7]。miR-23a在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)異常升高，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

同時(shí)，作者在本研究也發(fā)現(xiàn)miR-23a在舌鱗癌組織中表達(dá)明顯升高。因此，推斷miR-23a在舌鱗癌中也可能發(fā)揮致癌基因作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-23a過表達(dá)可明顯促進(jìn)舌鱗癌增殖，而封閉miR-23a表達(dá)可以抑制其增殖，與文獻(xiàn)所得的研究結(jié)果相符，miR-23a在舌鱗癌中發(fā)揮致癌基因作用，對miR-23a在腫瘤中的作用做了進(jìn)一步補(bǔ)充。

miRNAs通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)水平從而影響一系列生理病理過程。miR-23a可以直接靶定并調(diào)控NID2，ESRP1，XIAP等重要功能基因來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等[8]。PPP2R5E在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低。

本研究發(fā)現(xiàn)PPP2R5E在舌鱗癌組織中表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁組織，與miR-23a的表達(dá)趨勢相反，而且通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-23a確實(shí)可以與PPP2R5E3'UTR結(jié)合，因此，筆者推測在舌鱗癌中，PPP2R5E可能是miR-23a的潛在靶基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-23a可以抑制野生型PPP2R5E3'UTR熒光素酶活性，但不影響突變后的PPP2R5E3'UTR mut的熒光素酶活性， 改過表達(dá)miR-23a可以明顯抑制PPP2R5E mRNA的表達(dá)。因此，在舌鱗癌細(xì)胞中PPP2R5E確實(shí)是miR-23a的直接作用靶基因。miR-23a可以調(diào)節(jié)PPP2R5E的表達(dá)水平，進(jìn)而影響舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

綜上，本研究表明miR-23a可以通過直接靶定并下調(diào)PPP2R5E的表達(dá)水平促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖，為舌鱗癌的早期診斷和治療，提供了新的理論依據(jù)和潛在作用靶點(diǎn)。