聚醚醚酮生物支架制備和短期安全性的研究

鐘自玲 韓星 吳迪 瞿申紅

摘要：目的：通過3D打印技術(shù)制備出聚醚醚酮生物支架，進(jìn)一步評估支架材料的生物安全性。材料與方法：運(yùn)用熔融沉積成型工藝打印機(jī)打印出聚醚醚酮支架，制備材料浸提液用于體外試驗(yàn)，制備方片用于動物體內(nèi)試驗(yàn)。結(jié)果：溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、肌肉植入試驗(yàn)均證明了聚醚醚酮支架材料符合生物利用吸收的應(yīng)用要求。結(jié)論：3D打印聚醚醚酮支架材料短期內(nèi)具有良好的生物安全性。

關(guān)鍵詞：3D打印技術(shù);聚醚醚酮支架材料;生物學(xué)評價(jià);安全性研究。

【中圖分類號】G644.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）11-02

前言

耳部缺損修復(fù)目前所面臨的多種挑戰(zhàn)中包括耳廓重建，盡管耳廓只占人體很小比例，但卻有著極其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。多年以來，重建出滿意的外耳已經(jīng)成為廣大學(xué)者和科研人員共同追求的目標(biāo)[1]。隨著外科技術(shù)和生物組織工程技術(shù)的發(fā)展，生物工程培養(yǎng)軟骨成為耳廓重建的可能選擇以及臨床應(yīng)用最有希望和潛力的領(lǐng)域。耳廓重建的目標(biāo)不僅是形成精細(xì)的軟骨支架，還要盡可能做到耳廓支架不隨時間變化[2]。3D技術(shù)作為近年來迅猛發(fā)展的新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)，在生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展中也起著重要的作用。

聚醚醚酮（Polyetheretherketone， PEEK）作為一種生物替代材料，由于其與人骨相當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ?、?yōu)越的機(jī)械性能和優(yōu)良的生物相容性而受到廣泛的歡迎。曾經(jīng)，PEEK的疏水性和生物惰性限制了其臨床應(yīng)用，其較差的生物活性和骨融合性能導(dǎo)致種植體脫位，最終導(dǎo)致種植體失敗 [3-4] 。為了改善PEEK種植體的骨融合，人們做了許多嘗試。為研究3D打印技術(shù)打印出的PEEK支架是否具有良好的生物相容性，本研究設(shè)計(jì)了溶血試驗(yàn)和熱原試驗(yàn)對支架材料進(jìn)行評價(jià)，以期了解聚醚醚酮生物材料是否具有成功替代人體組織的可能性。

1材料和方法

PEEK材料浸提液的制備 用3D打印機(jī)打印出大小為10mm×10mm×1mm的PEEK支架材料的小方片，將方片用雙抗加PBS溶液清洗后通過酒精浸泡30min及紫外照射2h后備用。用生理鹽水作為浸提介質(zhì)，按照試樣表面積/浸提介質(zhì)=3cm2-6cm2/mL浸提，37℃ 72h，制得3D打印PEEK支架材料浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

溶血試驗(yàn) 浸提液置37℃恒溫水浴箱中保溫30min;用抗凝采血管經(jīng)兔耳中央動脈收集兔血10ml/只，按新鮮抗凝血：生理鹽水=4：5的比例制成稀釋兔血;設(shè)生理鹽水為陰性對照，蒸餾水為陽性對照，每試管10mL浸提液/生理鹽水/蒸餾水加稀釋兔血0.2ml，混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫60min，2500r/min，離心5min，取上清，用96孔板200μL/孔，在545nm波長測其吸光度。溶血率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-陰性對照組吸光度）/（陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度）×100%，溶血率大于5%為有溶血現(xiàn)象。

熱原試驗(yàn) 選取健康家兔6只，普通級，體質(zhì)量2.0-3.0kg。實(shí)驗(yàn)前禁食2h，將電子體溫計(jì)插入家兔肛門，深度約6cm，時間1min;間隔30min測3次體溫，取其平均值為正常值。設(shè)0.9%生理鹽水為陰性對照。浸提液/生理鹽水置于37℃恒溫水浴箱中預(yù)熱后按10ml/kg沿耳緣靜脈緩慢注入，注射后每隔1h測量1次體溫，共測3次，以3次中體溫最高值減去正常體溫即為體溫升高度數(shù)，觀察動物體溫的動態(tài)變化。

急性全身毒性試驗(yàn) 選取昆明系小鼠10只，SPF級，體質(zhì)量18-25g，隨機(jī)分成兩組，每組5只。按50mL/kg劑量由尾靜脈緩慢注入材料浸提液，對照組注射等量生理鹽水。觀察實(shí)驗(yàn)動物注射后一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)及死亡情況，并記錄注射后體重變化。

肌肉植入試驗(yàn) 制備10mm×10mm×1mm大小的聚醚醚酮小方片，經(jīng)滅菌處理后備用。選健康新西蘭白兔3只，雌雄不限，體重為2.Okg-3.0kg之間。腹腔注入10%水合氯醛2m1/kg，麻醉生效后，脫去術(shù)區(qū)背毛，嚴(yán)格消毒鋪敷，在兔脊柱旁1.5cm處做一縱形切口，約1-2cm，鈍性分離肌肉組織，深度約為1-2cm，植入聚醚醚酮支架后縫合肌筋膜和皮膚切口。于術(shù)后一周切取支架周圍0.5-1.Ocm厚肌肉組織，立即置于4%多聚甲醛中固定。將固定好的標(biāo)本置入包埋盒中，酒精梯度脫水，石蠟包埋，常規(guī)組織切片，伊紅—蘇木精染色（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下行組織學(xué)觀察。

2結(jié)果

溶血試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中陽性對照組吸光度值為0.931±0.016，陰性對照組吸光度值為0.096±0.002，實(shí)驗(yàn)組吸光度值為0.132±0.002，支架材料浸提液的平均溶血率為4.39%，小于5%，即認(rèn)為PEEK支架材料無溶血反應(yīng)，符合溶血試驗(yàn)要求。

熱原試驗(yàn)結(jié)果 耳緣靜脈注射實(shí)驗(yàn)組材料浸提液及生理鹽水后，兔體溫未見明顯升高。實(shí)驗(yàn)組中體溫升高值最高為0.4℃，陰性對照組體溫升高值最高為0.3℃，小于0.6℃，且體溫升高總值小于1.4℃，說明PEEK支架材料浸提液檢測合格，沒有明顯熱原物質(zhì)存在，符合實(shí)驗(yàn)要求。

急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)小鼠均無死亡，活動、進(jìn)食及大小便均正常，精神狀態(tài)良好，無驚厥、癱瘓、呼吸抑制等毒性反應(yīng)。不同觀察期動物體重均有一定程度的增加，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)組與對照組對比，二者體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

肌肉植入試驗(yàn)結(jié)果 病理切片HE染色結(jié)果如圖所示，術(shù)后一周，鏡下見肌肉組織排列整齊，呈現(xiàn)特殊橫紋形肌纖維組織，細(xì)胞核呈藍(lán)色，肌原纖維間肌質(zhì)網(wǎng)呈紅色或紫紅色，炎癥反應(yīng)分級：0級。肌肉周圍纖維包膜無明顯炎癥反應(yīng)，無液化、肥大等病理反應(yīng)，無膿腫形成。

3討論

最近，使用融合沉積建模（FDM）技術(shù)制造PEEK支架已被描述，它具有許多優(yōu)點(diǎn)，如材料損耗少、成本效益高、易于操作人員培訓(xùn)、更快的植入物生產(chǎn)和提高患者特異性[5]。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用PEEK的一個主要問題是缺乏生物相容性和生物活性[6-8]。Feng等的死/活染色研究顯示，大量綠色染色的活細(xì)胞和少量紅色染色的死細(xì)胞存在于支架表面，所有測試的PEEK支架都具有生物相容性[9]。Gu等[10]通過建立兔眼眶缺損模型，將PEEK植入物實(shí)驗(yàn)組與空白對照組對比，發(fā)現(xiàn)PEEK植入后無感染和排斥反應(yīng)發(fā)生，生物相容性良好。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組骨缺損修復(fù)效果明顯優(yōu)于同期對照組，并有一定的成骨效果。

耳廓由皮膚血管及內(nèi)部的耳廓軟骨構(gòu)成，用PEEK材料制作的完整耳廓硬度明顯高于正常組織。因此，由于實(shí)心的生物支架往往與正常組織差異較大且不符合生物體原本組織結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能，目前的研究已經(jīng)報(bào)道了幾種制備表面多孔PEEK支架的方法。Yuan等[11]采用化學(xué)方法（酸磺化處理和模擬流體培養(yǎng)的仿生礦化）建立多孔PEEK支架，其骨融合和力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于致密PEEK支架。Evans等[12]通過物理方法（熔體擠壓和鹽浸）制備了表面多孔的PEEK支架，增強(qiáng)了大鼠股骨缺損模型的骨融合。然而，這些傳統(tǒng)技術(shù)無法精確控制孔隙大小、孔隙率或支架的連通性。此外，殘留雜質(zhì)或死區(qū)問題也已被注意到[13]。因此，孔隙結(jié)構(gòu)對多孔PEEK支架力學(xué)性能和生物性能的影響仍有待進(jìn)一步研究。

就單純PEEK材料缺乏生物活性的問題，已經(jīng)制定了一些策略來解決這一限制。羥基磷灰石（HA）-聚醚醚酮（PEEK）復(fù)合材料的制備β-磷酸三鈣（β-TCP）已被證明可以增強(qiáng)生物活性[14，15]。Zhu和他的同事等[7] 開發(fā)了一種簡單的浸泡方法來生成生物相容性和生物活性的PEEK，從而誘導(dǎo)骨分化。他們的研究發(fā)現(xiàn)，與PEEK對照相比，改性PEEK在體外顯示出了顯著改善細(xì)胞增殖、成骨分化和骨樣磷灰石形成的能力。在耳廓重建中是否有著同樣的問題和效果尚需更深入的研究。

4結(jié)論

溶血試驗(yàn)和熱原試驗(yàn)是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織規(guī)定的生物材料應(yīng)用于生物體必須通過的實(shí)驗(yàn)研究，通過對PEEK材料的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，我們驗(yàn)證了其具有良好的生物相容性，可用于進(jìn)一步的組織工程學(xué)研究。但由于其硬度與正常耳廓相差較大，有必要對其力學(xué)性能進(jìn)行改進(jìn)，通過改變表面特性、增加孔隙、添加復(fù)合物等手段使PEEK材料更接近正常耳廓，具體設(shè)計(jì)方案尚需進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sinwar PD. Auricle injury due to human bite - A rare case report and review literature. Int J Surg Case Rep 2015; 6c： 5-7.

[2] Han SE， Lim SY， Pyon JK， Bang SI， Mun GH， Oh KS. Aesthetic auricular reconstruction with autologous rib cartilage grafts in adult microtia patients. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2015; 68（8）： 1085-94.

[3] Wang S， Yang Y， Li Y， et al. Strontium/adiponectin co-decoration modulates the osteogenic activity of nano-morphologic polyetheretherketone implant. Colloids Surf B Biointerfaces 2019; 176： 38-46.

[4] Phan K， Hogan JA， Assem Y， Mobbs RJ. PEEK-Halo effect in interbody fusion. J Clin Neurosci 2016; 24： 138-40.

[5] Zhao F， Li D， Jin Z. Preliminary Investigation of Poly-Ether-Ether-Ketone Based on Fused Deposition Modeling for Medical Applications. Materials （Basel， Switzerland） 2018; 11（2）.

[6] Zhang J， Tian W， Chen J， Yu J， Zhang J， Chen J. The application of polyetheretherketone （PEEK） implants in cranioplasty. Brain Res Bull 2019; 153： 143-9.

[7] Zhu Y， Cao Z， Peng Y， Hu L， Guney T， Tang B. Facile Surface Modification Method for Synergistically Enhancing the Biocompatibility and Bioactivity of Poly（ether ether ketone） That Induced Osteodifferentiation. ACS Appl Mater Interfaces 2019; 11（31）： 27503-11.

[8] Lu T， Wen J， Qian S， et al. Enhanced osteointegration on tantalum-implanted polyetheretherketone surface with bone-like elastic modulus. Biomaterials 2015; 51： 173-83.

[9] Feng X， Ma L， Liang H， et al. Osteointegration of 3D-printed fully porous polyetheretherketone scaffolds with different pore sizes. ACS omega 2020; 5（41）： 26655-66.

[10] Gu RD， Xiao F， Wang L， Sun KJ， Chen LL. Biocompatibility of polyetheretherketone for the treatment of orbital bone defects. International journal of ophthalmology 2020; 13（5）： 725-30.

[11] Yuan B， Cheng Q， Zhao R， et al. Comparison of osteointegration property between PEKK and PEEK： Effects of surface structure and chemistry. Biomaterials 2018; 170： 116-26.

[12] Evans NT， Torstrick FB， Lee CS， et al. High-strength， surface-porous polyether-ether-ketone for load-bearing orthopedic implants. Acta Biomater 2015; 13： 159-67.

[13] Li F， Li J， Xu G， Liu G， Kou H， Zhou L. Fabrication， pore structure and compressive behavior of anisotropic porous titanium for human trabecular bone implant applications. J Mech Behav Biomed Mater 2015; 46： 104-14.

[14] Kokubo T， Kim HM， Kawashita M. Novel bioactive materials with different mechanical properties. Biomaterials 2003; 24（13）： 2161-75.

[15] Kane RJ， Converse GL， Roeder RK. Effects of the reinforcement morphology on the fatigue properties of hydroxyapatite reinforced polymers. J Mech Behav Biomed Mater 2008; 1（3）： 261-8.

基金資助：2018年廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（桂科AB1850010）;2018年廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)開發(fā)與推廣應(yīng)用項(xiàng)目（S2018039）;廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSW2021215）

作者簡介：*瞿申紅，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：3D打印在耳鼻咽喉頭頸外科中的應(yīng)用研究。郵箱：2510243342@qq.com