基于WGCNA的忍冬鹽脅迫響應調控網絡分析及核心基因發掘

中圖分類號：S567.239：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）09-0009-13

Identification of Salt-Related Co-expression Modules and Hub Genes in Lonicera japonica Based on WGCNA

Huang Luyao'，Hou Congzhe2，Liu Zhenhua’，Duan Tongyao2，Li Zhuangzhuang'，Wang Bin ¹ ， Li Jia ¹ （1. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 25oooo， China;2.Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 25Oooo，China）

Abstract Weighted gene co-expression network analysis （WGCNA） is a classic system biology analysis method，which could be used to identify co-expressed gene modules，explore the biological corelation between modulesand target traits，and mining hub genes in the modules.In this study，15 sets of transcriptome data were collected from Lonicera japonica leaves treated with 300mmol?L^-1 NaCl for 0，12，24，48 and 72 hours. The WGCNA method was used to identify gene co-expresson modules response to salt stress in L. japonica， and a total of 8 co-expression modules were obtained. The gene expresion patterns of the Brown and Black modules showed a negative to positive trend with the extension of NaCl treatment time，and the correlation between the two modules in module eigengene（ME）was relatively higher，indicating that the Brown and Black modules were salt-resistant specific modules in L. japonica.By calculating the connectivity of genes within the module，four hub genes in the Black module and ten hub genes in the Brown module were obtained.Functional annotation suggested that these genes may play important roles in the salt resistant process of L. japonica. The results of relative gene expression analysis showed that the expression level of most hub genes were inversely proportional to stress time，manifestedas an increase in expression level at 12 hours of salt stress and then a decrease.The hub genes Ljap00036010，Ljap00006511，and Ljap00032341，whose expression levels significantly increased at12 hours，were all involved in the plant photo response pathway，indicating that he hub genes may function in the early stage of salt stress response in L. japonica through rapid transcription，especially in the rapid response of the photo response pathway.This study provided further understanding of the regulatory network of L . japonica in response to salt stress， which was of vital importance for breeding salt-tolerant plants adapt to saline-alkali land，developing the honeysuckle industry and exploring and utilizing of saline-alkali land. However，the functions and mechanisms of the hub genes need to be further studied.

KeywordsLonicera japonica ; Response to salt stress； Weighted gene co-expression network analysis（WGCNA） ;Gene module;Hub genes

隨著高通量測序技術的飛速發展和測序成本的降低，海量的測序數據產生。加權基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network a-nalysis，WGCNA）是基于植物體內生命活動互相關聯的特點，利用轉錄組測序獲得基因表達數據，通過軟閾值鑒定表達模式相似的基因模塊，并特異性關聯與目標性狀相關的共表達模塊[1-2]WGCNA網絡中存在少數與其他大多數基因都有聯系的基因，可能是網絡中的關鍵調控基因，通過相關性分析可以預測位于網絡中心的這些少數基因。WGCNA多被用于研究共表達網絡與植物性狀之間的生物學關系，挖掘與性狀高度關聯的關鍵基因，并結合基因功能注釋發現參與特定代謝途徑的共表達模塊以及預測新基因的功能[3]自2008年Langfelder和 Horvath[4]提出 WGCNA以來，研究人員通過該方法挖掘得到許多調控植物表型性狀、響應生物或非生物脅迫等方面的關鍵基因：如利用WGCNA挖掘粳稻抗低溫脅迫差異基因時得到4個抗低溫核心基因[5]；通過WGCNA挖掘得到bHLHI15、HAK5、NAGS2、DUF699等模塊核心基因，可能在甘薯逆境脅迫響應中發揮重要作用[6-7]

忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是我國歷史悠久的藥用植物，其干燥花蕾是中醫臨床清熱解毒的首選藥物—金銀花[8-9]。忍冬的藥用價值、經濟價值和生態價值已在我國得到廣泛認可。

據統計，約 10% 的臨床處方配有金銀花，而且其在保健品、化妝品、食品、園林綠化等領域的價值也被逐漸挖掘[10]。忍冬在我國大部分地區均有分布，已在許多地區栽培并形成規模化種植產業，配以標準化的種植管理體系，成為許多地區的支柱產業，尤其以省和河南省最為聞名[]。多項研究證明，忍冬具有一定的耐鹽堿能力，鹽堿地種植可以促進中藥材金銀花中有效成分的積累；另外，高鹽環境誘導忍冬根部呼吸作用增強，通過增加 Na⁺ 的外排來增強忍冬的耐鹽性，但其具體機制尚不清晰[12]。利用先進的生物信息學技術挖掘鹽堿地忍冬抗鹽關鍵調控基因、選育耐鹽堿品種適應鹽堿地，對金銀花產業發展和鹽堿地開發利用至關重要。

本研究利用 300mmol?L^-1NaCl 處理忍冬0、12，24，48，72h 時獲得的15份轉錄組數據，構建WGCNA共表達網絡，鑒定與鹽脅迫顯著相關模塊并進行連通性分析，預測模塊中核心基因并進行功能注釋，以挖掘忍冬鹽脅迫響應基因，為其基因網絡和功能研究及適合鹽堿地種植忍冬的分子育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 忍冬轉錄組數據的獲取與分析

忍冬鹽脅迫轉錄組數據來自中藥資源學課題組未發表數據。該課題組以二年生忍冬品種“華金6號”為植物材料，于2020年9月選取生長狀態一致的忍冬枝條進行捍插盆栽；2021年6月上旬選取處于營養生長期（均未開花）的植株，利用 300mmol?L^-1 NaCl溶液澆灌進行鹽脅迫處理，分別在處理 0h（S0） 、12h（S12）24h（S24）48h（S48）72h（S72） 摘取忍冬葉片，每個時間點3組重復，每組重復8株忍冬。由北京貝瑞和康生物技術有限公司利用IIlu-minaNovaSeq6000平臺進行轉錄組測序，得到各樣本的基因表達數據，用FPKM（fragmentsperki-lobase of exon per million fragments mapped）值表示基因的表達水平。

1.2 加權基因共表達網絡的構建

按照基因表達量均值大于1且超過一半的樣本表達量大于0、變異系數大于0.2的要求對選用的基因集進行篩選過濾。基因的表達量矩陣來自標準化的15個鹽脅迫轉錄組數據的基因表達量，使用RStudio 軟件的WGCNA 包（version3.6.1）計算權重值，構建加權基因共表達網絡。首先根據基因表達量對所有樣本進行聚類，用WGCNA包中的pickSoftThreshold函數計算共表達網絡的加權系數β；當 β 為24時，無尺度網絡擬合指數 R² 接近0.8，平均連通性趨于0（圖1），確定以該 β 值作冪處理可以獲得符合要求的無尺度網絡；用blockwiseModules構建無尺度網絡，利用動態剪切算法（dynamic treecut）進行聚類和模塊劃分，并計算各模塊的特征向量值；基于基因間表達量的相關性構建基因聚類樹，然后據基因間的聚類關系劃分基因模塊，根據模塊的特征值相似度合并表達模式相近的模塊。設置最小模塊基因數為50，相似模塊的合并閾值為0.25（MergeCutHeight ?=?0.25 ），其他參數按照默認設置。

A：不同軟閾值情況下的無尺度網絡分布;B：不同軟閾值情況下的網絡連通性。

圖1 軟閾值（β）的選擇

1.3 鹽脅迫響應特異性模塊的鑒定

對每個共表達模塊中的基因進行主成分分析（principlecomponentanalysis，PCA），主成分1（PC1）即為該模塊的特征向量（module eigenge-ne，ME）。為了篩選與鹽脅迫相關的特異性模塊，計算各模塊的ME值與鹽脅迫時間的相關系數r以及顯著性 P 值，當 |r|gt;0.50 且 Plt;0.05 時認為該模塊是與耐鹽性顯著相關的特異性模塊，選擇相應模塊進行后續研究。另外，根據已報道的脅迫相關基因及差異表達基因的注釋信息，分析差異基因所在的表達模塊，輔助驗證特異性模塊。

1.4 模塊基因的GO功能富集分析

將脅迫相關模塊中的基因提交到agriGO（ht-tps：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/） 網站，利用單一富集分析方法（singular enrichment anal-ysis，SEA）進行富集分析，利用Fisher's校驗和Bonferroni多重校驗進行顯著GO類型的篩選

1.5 模塊基因的KEGG代謝通路分析

利用KOBAS（v3.0）軟件進行模塊基因的KEGG富集分析，選擇顯著富集的前20個Path-way進行統計，統計富集的基因數目并作圖。

1.6 鹽脅迫響應特異性模塊核心基因的鑒定及功能注釋

利用STRING（https：//cn.string-db.org/）在線網站獲得模塊基因的互作關系。利用Cytoscape（version3.9.1）對模塊中的網絡進行可視化處理，篩選出模塊中連通性高的基因作為該模塊的核心基因。利用TAIR 數據庫（https：//www.arabidop-sis.org/）和 UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/uniprotkb/）注釋核心基因在擬南芥中的同源基因的功能。

1.7 核心基因的表達模式分析

利用轉錄組測序的植物材料，對獲得的核心基因進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，驗證其在鹽脅迫不同時間點的表達量。

參照植物RNA提取試劑盒說明書（FastPurePlantTotalRNAIsolationKit）提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書（PrimeScriptRTreagent KitwithgDNAEraser）獲得忍冬cDNA，反轉錄體系如表1所示，反應條件為 37^°C15min，85^°C5s ，4°C 保存。

表1反轉錄反應體系

利用Oligov7.0設計qRT-PCR引物，以LjAc-tin作為內參基因，引物序列見表2。

qRT-PCR的反應體系如表3所示。采用SYBRGreen法進行qRT-PCR實驗，反應程序為： 預變性; 95^°C 10s變性 .55°C30s 退火 .72°60s 延伸，39個循環，并同時采集熒光信號。各進行3次生物重復和3次技術重復。基因的相對表達量按照 2^-ΔΔCt 法進行計算。

表2qRT-PCR引物序列

表3qRT-PCR的反應體系

2 結果與分析

2.1 忍冬加權基因共表達網絡構建

采用動態剪切法劃分模塊，隨之依次計算每個模塊的特征向量值，對距離較近的模塊進行合并，最終構建了8個共表達模塊，用不同顏色表示不同模塊（圖2）。各模塊所含基因數量如圖3所示，其中，Turquoise模塊所含基因最多，為3605個;Black模塊中基因最少，為146個;其他模塊的基因數介于 484～1 618 個之間。

圖2基因聚類樹和模塊分割

圖3各模塊中基因數量分布

2.2 忍冬鹽脅迫響應特異性模塊的鑒定

由圖4可知，本研究共鑒定到8個與鹽脅迫響應特異相關的基因共表達模塊 （Δrgt;0.50，Plt; 0.05）。其中，Grey模塊與鹽脅迫 ^12h 高度正相關，Green模塊與鹽脅迫 24h 高度正相關，Blue模塊與鹽脅迫 ^48h 高度正相關，Black模塊與鹽脅迫 ^72h 高度正相關。值得注意的是，Brown模塊和Black模塊的基因表達隨著NaCl處理時間的增加均存在負轉正的變化趨勢，與NaCl處理 ^12h 和 24h 呈負相關，與NaCI處理 ^48h 和 ^72h 呈正相關。

模塊特征向量（ME）代表該模塊的整體表達趨勢，與ME相關性最高的基因被稱為特征向量基因（eigengene-basedhub genes）。模塊間的相關性則由各自ME的皮爾遜相關性度量。結果顯示，Brown模塊與Black 模塊的 ME呈顯著負相關 Φ_r=-0.86 ，圖5），提示二者在抗鹽響應中可能發揮拮抗作用，因此將這兩個模塊列為忍冬抗鹽特異性模塊進一步研究。

圖4模塊與鹽脅迫時間的相關性熱圖

行和列分別為模塊和鹽脅迫時間，矩形框里的數字為相關系數 r 及相應 P 值（括號里的值）。右側熱圖色階（橙藍色漸變）表示相關系數 r 的變化。

圖5 不同模塊之間ME的相關性

A：模塊與模塊關系聚類圖；B：模塊與模塊關系熱圖。

2.3 Black和Brown模塊特征向量基因的GO富集分析

為研究特異性模塊主要參與的生物途徑和分子功能，對Black、Brown模塊中ME相關性最高的特征向量基因進行GO富集分析，結果顯示均顯著富集到生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和細胞組分（cellularcomponents，CC）的若干通路。如圖6所示，Black模塊基因顯著富集到氧化還原酶活性（ oxidoreductaseactivity； GO： O016491， GO：0016705）、單加氧酶活性（monooxygenase activity;GO：0004497）等分子功能，以及碳水化合物代謝過程（carbohydratemetabolicprocess；GO：0005975）等生物過程。Brown模塊顯著富集到金屬肽酶 活 性（metallopeptidaseactivity；GO：0008237）、金屬內肽酶活性（metalloendopeptidaseactivity；G0：0004222）次級活性跨膜轉運蛋白活性（secondary active transmembrane transporter ac-tivity;GO：0015291）維生素結合（vitaminbind-ing;GO：0019842）等分子功能，以及氨基酸代謝過程（amino acid metabolic process ; GO：0006520）、氧代酸代謝過程（oxoacidmetabolicprocess;GO：0043436）有機酸代謝過程（organicacidmetabolicprocess;GO：0006082）和羧酸代謝過程（carboxylicacidmetabolicprocess;GO：0019752）等生物過程

2.4Black 和Brown 模塊特征向量基因的KEGG代謝通路分析

為進一步挖掘Black和Brown模塊的功能，分別選取Black和Brown模塊中ME相關性最高的特征向量基因進行KEGG代謝通路分析，結果（圖7）顯示，Black模塊基因主要參與過氧化物酶體（Peroxisome）和甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）以及細胞過程（CellularProcesses）、運輸和分解代謝（Transportandcatabolism）、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化（Pentose and glucuronate interconversions）等代謝通路。Brown模塊基因主要參與脂肪酸降解（Fattyacid degradation）、甘油酯代謝（Glycero-lipidmetabolism）、酪氨酸代謝（Tyrosinemetabo-lism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabo-lism）等代謝通路。其中，兩個模塊基因均富集到類胡蘿卜素生物合成（Carotenoidbiosynthesis）、抗壞血酸和阿糖二酸代謝（Ascorbate andaldarate otheraminoacids）及半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cys-bolism）、其他氨基酸的代謝（Metabolismof teine and methionine metabolism）途徑。

2.5核心基因鑒定與功能注釋

利用Cytoscape軟件對Black、Brown模塊的基因調控網絡進行可視化（圖8），從中篩選出高連通性的基因作為模塊的核心基因，最終從Black模塊篩選出4個核心基因（Betweeness ?150 ），從Brown模塊篩選出10個核心基因（Betweeness ?13000 ）。

圖7Black 模塊（A）和Brown模塊（B）的KEGG代謝通路分析

對核心基因在擬南芥中的同源基因的功能進行注釋分析，結果（表4）顯示，Black模塊中的核心基因分別為1-脫氧-D-酮糖-5-磷酸合成酶基因（Ljap00014442）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因（Ljap00010910）乙醛脫氫酶基因（Ljap00034405）和三磷酸異構酶基因（Ljap00026351）。Brown模塊中的核心基因包括：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Ljap00027241）蛋白磷酸酶2C和含環狀核苷酸結合/激酶結構域的蛋白質編碼基因（Ljap00009432）、延伸因子Tu基因（Ljap00025796）、共濟蛋白編碼基因（Ljap00022347）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STN7基因（Ljap00036010）、二磷酸核糖羧化酶/加氧酶活化酶基因（Ljap00006511）呼吸爆發氧化酶同源蛋白C樣基因（Ljap00032850）、轉錄因子HY5基因（Ljap00032341）、玉米黃質環氧化酶基因（Ljap00012517）和細胞色素c基因（Ljap00018165）。

圖8Black模塊（A）和Brown模塊（B）的基因共表達網絡及核心基因

表4不同模塊中核心基因的功能注釋

2.6核心基因表達模式的qRT-PCR分析

轉錄組分析的基因表達量（圖9）與qRT-PCR分析的基因相對表達量結果（圖10）趨勢相似，說明測序結果可信。Black模塊和Brown模塊核心基因的表達模式相似，多數基因呈現鹽脅迫^12h 表達量增加而后降低的趨勢。14個核心基因可聚成3類，分別為GroupI、GroupⅡI和GroupⅢ，其中，GroupI中基因在鹽脅迫下的表達量變化不大，GroupⅡ和GroupI中基因的表達量均在12h 增加而后降低，但GroupⅢ中基因的表達量在脅迫 12h 時顯著增加。

圖9核心基因響應鹽脅迫表達的轉錄組分析

熱圖色階（橙藍色漸變）表示基因表達量的倍數變化。

logFC=log₂ （處理組的平均表達量/對照組的平均表達量）。

圖10核心基因響應鹽脅迫表達的qRT-PCR分析

3 討論

植物在長期適應鹽脅迫的過程中形成了應對鹽脅迫的分子機制。本研究利用忍冬鹽脅迫不同時間的轉錄組數據構建了WGCNA網絡，挖掘出忍冬特異性鹽脅迫應答模塊Brown和Black模塊及其核心基因。

Black模塊中鑒定的4個核心基因均與脅迫響應相關。Ljap00014442在擬南芥中的同源基因At4gI5560 編碼1-脫氧-D-酮糖-5-磷酸合成酶，是質體類異戊二烯生物合成的限制酶，對葉綠體發育至關重要[13]。植物釋放的異戊二烯具有多項生理學功能，如提高植物對高溫的耐受性[14]作為一種抗氧化劑清除植物因脅迫而產生的過量活性氧（ROS），保護光合器官免受氧化損傷[15-16]。Ljap00010910 在擬南芥中的同源基因At3gO2360 編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，是催化磷酸戊糖途徑第三步反應的酶，將NADP還原為NADPH，不僅參與多種非生物脅迫，還影響植物生長[17-20]。Ljap00034405 在擬南芥中的同源基因 At3g48000 編碼乙醛脫氫酶，與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶均屬于氧化還原酶類[21]。研究表明，乙醛脫氫酶催化內源或外源醛類氧化為相應羧酸，從而降低細胞毒性、緩解氧化脅迫。逆境脅迫下細菌、植物、酵母、線蟲、哺乳類動物等生命體的乙醛脫氫酶表達普遍出現上調，但功能模式不盡相同[22-23]。Ljap00026351 在擬南芥中的同源基因At3g55440編碼三磷酸異構酶，是一種參與碳代謝的關鍵酶，在糖酵解和脂肪酸合成等途徑中具有非常重要的作用，響應多種逆境脅迫[24] 。

Brown模塊中的核心基因功能多與脅迫響應相關。核心基因Ljap00027241在擬南芥中的同源基因 AtlgI3440 編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是糖酵解中的關鍵酶，對維持細胞ATP水平和碳水化合物代謝至關重要[25]。在擬南芥的應激反應中，胞漿甘油醛-3-磷酸脫氫酶與磷脂酶8相互作用以轉導 H₂O₂ 信號[26]。Ljap00009432 在擬南芥中的同源基因 At2g20050 編碼蛋白磷酸酶2C，通過影響植物體內多種代謝過程、激素調控參與植物對鹽堿、干旱、低溫等脅迫的適應[27-28]Ljap00025796在擬南芥中的同源基因 At4gO2930 編碼蛋白延伸因子 Tu ，是蛋白質翻譯延伸階段中一類重要的蛋白因子，在蛋白質生物合成過程中促進氨酰基tRNA與核糖體A位點的GTP依賴性結合[29]。Ljap00022347 在擬南芥中的同源基因 At4gO3240 編碼共濟蛋白，通過向參與這些途徑的蛋白質遞送 Fe²⁺ ，促進血紅素的生物合成以及鐵硫簇的組裝和修復，可能通過其催化 Fe²⁺ 氧化為 Fe³⁺ 的能力在對抗鐵催化的氧化應激中發揮作用[30]。Ljap00032850 在擬南芥中的同源基因At5g479IO 編碼呼吸爆發氧化酶同源蛋白，是產生超氧化物的鈣依賴性NADPH氧化酶，參與調節細胞ROS的穩態，與植物應對病原菌等生物脅迫及高溫、十旱和高鹽等非生物脅迫的代謝反應。

有關[31-33] Ljap00012517在擬南芥中的同源基因 At5g67030 編碼玉米黃質環氧化酶，在葉黃素循環和脫落酸（ABA）生物合成中發揮重要作用，是滲透脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫抗性以及ABA依賴性氣孔關閉、種子發育和休眠、防御基因表達的調節、抗病性、非光化學猝滅（NPQ）所必需的[34-39]

轉錄組測序數據和qRT-PCR結果顯示，Black模塊和Brown模塊多數核心基因的表達量隨鹽脅迫時間延長先增加后降低，其中LjapO0036010、Ljap00006511、Ljap00032341在鹽脅迫 12h 被顯著誘導，推測其在忍冬應對鹽脅迫過程中發揮重要功能。Ljap00036010在擬南芥中的同源基因Atlg68830編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STN7是通過磷酸化光捕獲復合物II外觸角（LCHII）進行狀態轉換所需的，狀態轉換在植物響應環境變化中起著核心作用[40]。Ljap00006511在擬南芥中的同源基因 At2g39730 編碼二磷酸核糖羧化酶/加氧酶活化酶，主要功能為核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的激活涉及賴氨酸的ε-氨基的ATP依賴性羧化，從而導致氨基甲酸酯結構，響應高溫、鹽堿、高溫在內的多種脅迫[41]。Ljap00032341在擬南芥中的同源基因At5g11260編碼堿性亮氨酸拉鏈（basicleucinezipper，bZIP）類型的光轉錄因子HY5，在促進光形態發生和植物激素的信號傳遞過程中起著極其重要的作用，可單獨或與其他調控因子一起參與并調控植物生長發育的生理功能[42]。如HY5 通過激活光保護參與調節低溫誘導的光抑制[43]；HY5直接或者間接通過MYB15調節CBF轉錄水平，增強低溫脅迫下植物的耐寒性[44]。綜上，Ljap00036010、Ljap00006511 和 Ljap00032341均參與植物的光響應途徑，推測光響應途徑的快速應答是植物應對鹽脅迫的關鍵策略，3個核心基因的功能和作用機制值得深入探究。

4結論

本研究對忍冬鹽脅迫處理的經質控的轉錄組表達矩陣進行了WGCNA分析，得到了忍冬鹽脅迫特異性響應模塊Brown和Black模塊，分別挖掘得到核心基因10個和4個，這些基因受鹽脅迫誘導在 ^12h 高表達，推測其在忍冬抗鹽過程中發揮重要功能。其中，注釋到光響應途徑中的3個核心基因Ljap00036010、Ljap00006511和Ljap00032341功能和作用機制值得深入研究。本研究側重分析了與鹽脅迫時間相關性顯著由負轉變為正的模塊，但未對其他模塊中存在的也可能參與忍冬耐鹽脅迫的一些重要基因進行分析。本研究所分析的核心基因在忍冬中的功能及作用機制尚未明確，后續需要通過分子生物學試驗進一步驗證。

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