基于轉錄組測序鑒定大豆響應鋁毒脅迫的轉錄因子

中圖分類號：S565.1：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）09-0022-09

Identification of Transcription Factors in Response to Aluminum Toxicity Stress in Soybean Based on Transcriptome Sequencing

Wu Lanhua， Song Yingpei， Kong Keke，Wang Can，Wu Yang， Zhou Huiwen （College of Pharmacy and Life Sciences，Jiujang University/Soybean Research Institute，Jiujiang 3320o5，China）

AbstractIdentification of the transcription factors （TF） in response to aluminum（Al） toxicity stress in soybean is conducive to the analysis of the molecular mechanism of soybean resistant to Al toxicity.In this study，Al-tolerant soybean germplasm Nannong 99-6 （NN99-6）and Al-sensitive soybean germplasm Zhongdou 32（ZD32） were used as materials. After AlC1₃ treatment， the differential expression TFs （DETFs） were detected by RNA-seq，the functional annotations and protein interaction analysis were performed，and the expresion levels of the key TF genes detected by qRT-PCR.The results showed that 387 DETFs were obtained in response to Al toxicity stress，and 83of which showed diffrential expression patterns between Al-tolerant and Al-sensitive soybean germplasms.Five key DETFs interacted with each other， containing NAC6， WRKY58，WRKY30，WRKY57 and I1MEN3_SOYBN. Compared with 0h ， the five DETFs genes were significantly up-regulated at 6，12，24，48 h and ^72h under Al toxicity stress，and the expression level of WRKY58，WRKY30 and WRKY57 increased with the extension of treatment time.In conclusion，this study identified that five key DETFs might play important regulatory roles in soybeanresponse to Al toxicity stress. The result could provide a theoretical support for verifying the function of Al resistance related genes in soy bean.

KeyWordsSoybean; Al toxicity stress； Diferential expression TF genes； Protein interaction; NAC;WRKY

大豆是世界上重要的油料作物，為人類提供了大量的食用油和高蛋白原料。但是目前土壤酸化問題日趨嚴重，越來越多的農作物主產區(qū)土壤pH 值在5.5以下[1-3]。當土壤 pH 值低于5.5時，土壤中的鋁離子（主要是 Al³⁺ 、Al（OH）2+和Al（OH）₂⁺. ）逐漸從固態(tài)硅酸鹽或者氧化物中釋放出來，形成鋁毒脅迫[4]。植物長時間處于鋁毒環(huán)境，根尖伸長受到抑制，主根增粗、變短，側根數(shù)目減少，根系受到嚴重破壞，限制根系吸收水分與營養(yǎng)元素，促使葉片發(fā)黃，影響光合作用，最終造成農作物減產，甚至死亡[4-7]。因此，在酸性土壤中，鋁毒是大豆生長發(fā)育的主要限制因子之一。

作物進化過程中，逐漸建立了抵御鋁毒的能力，主要方式有外排和內吞[8]。這兩種解毒方式受諸多基因調控，如編碼蘋果酸轉運蛋白相關基因（TaALMT1、AtALMT1、BnALMT1、GmALMT1、ScALMT1等）、檸檬酸轉運蛋白相關基因（HvAACT1、OsFRDL4、ZmMATE1、GmFRD3b等），它們通過參與分泌和轉運有機酸螯合鋁離子進行解毒[8-10]。UGT85A111、UGT83R1通過調控細胞壁的合成參與植物響應鋁毒脅迫[1]。在復雜的解毒過程中，有諸多轉錄因子參與調控作物響應鋁毒脅迫。鋅指蛋白STOP1轉錄因子經增加蘋果酸轉運體ALMT的轉錄表達，調控植物對鋁毒的響應[12-14]; AP2/ERF、MYB、WRKY、NAC、RAE等轉錄因子均參與植物耐鋁毒過程[15-18]。除了已報道的轉錄因子調控植物耐鋁毒性外，是否存在其他類型的轉錄因子參與調控大豆耐鋁毒性仍需進一步探究。

隨著高通量技術與生物信息學方法的發(fā)展，轉錄組測序已成熟應用于挖掘植物響應非生物脅迫的TF基因。張斌等[19]從水稻響應鹽脅迫轉錄組測序結果挖掘出2個關鍵轉錄因子Os03g0745000、Os06g0553100；基于轉錄組測序結果，魯琳等[20]發(fā)現(xiàn)在煙草中響應低溫脅迫較多的TF家族有NAC、ERF、MYB、WRKY這4類轉錄因子，袁嘉志等[2在大豆中也鑒定到了18個響應鹽脅迫的NAC轉錄因子。因此，可利用轉錄組測序結果篩選大豆響應鋁毒脅迫TF基因。

本研究基于轉錄組測序結果挖掘大豆響應鋁毒脅迫的相關差異表達TF基因，根據(jù)GO和KEGG功能注釋以及蛋白互作網絡篩選出鋁毒脅迫關鍵TF基因，經qRT-PCR驗證候選基因在不同時段的表達水平，為后期篩選大豆抗性基因、培育大豆耐酸鋁新品種提供重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以前期篩選出的耐鋁毒大豆種質南農99-6、鋁毒敏感大豆種質中豆32為試驗材料[22]，2022年6月挑選籽粒飽滿、大小一致的種子，均勻播種于沙盆中。播種后第4天將長勢一致的幼苗轉移至 0.5mmol/L 的 CaCl₂ 溶液 （ pH 值4.3）中過渡培養(yǎng) 24h ，之后轉移至 150μmol/L 的 AlCl₃ 溶液處理，溶液中添加1/16Hoagland營養(yǎng)液，對照組為不加 AlCl₃ 的營養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：溫度 26^°C/24^°C （晝/夜）光照時長 14h/10h （晝/夜），大豆培育方式參照周會汶等[22]的方法。處理 ^72h 后，分別進行整根取樣，迅速置于液氮中速凍備用。設置3次重復，每個重復4個單株。

1.2 轉錄組分析

1.2.1轉錄組測序與差異表達TF基因的篩選采用RNAprepPurePlantkit提取大豆根系總RNA，經檢測合格、構建測序文庫后，使用IluminaNovaseq6000測序平臺進行轉錄組測序。對原始數(shù)據(jù)進行過濾后獲得高質量reads，以Williams82為參考基因組，以FPKM值表示基因的表達量，在NR、Swissprot、PFAM、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。差異表達TF基因的篩選條件為P -value lt;0.05 ， 。 log₂FC=log₂ （處理組FPKM/對照組FPKM）。轉錄組測序委托武漢邁特維爾生物科技有限公司進行。

1.2.2差異表達TF基因的功能富集分析根據(jù)差異表達TF基因的GO、KEGG功能注釋信息，在邁維云平臺（https：//cloud.metware.cn/#/home）進行GO、KEGG富集分析。

1.2.3 互作蛋白網絡的構建利用蛋白互作預測在線數(shù)據(jù)庫 ，設置參數(shù)（interaction score ?0.4 ），構建蛋白互作網絡。

1.3TF基因在鋁毒不同處理時間表達水平的檢測

在南農99-6和中豆32播種后第4天，將長勢一致的芽苗轉移至含 150μmol/LAlCl₃ 營養(yǎng)液（ pH 值4.3）中，分別在處理 0.6、12、24、48、72h 取整個根系，液氮中速凍， -80°C 保存?zhèn)溆谩＠肧tarSpin柱式植物RNA提取試劑盒（北京世紀康潤醫(yī)藥經營有限責任公司）提取根系總RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]合成cDNA。利用朗基熒光定量PCR儀Q2000C，參照TB Green@ Premix Ex TaqTM[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]試劑盒說明書，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測轉錄因子表達水平，設3次重復，通過 2^-ΔΔCt 計算目的基因相對表達量[23]。利用在線軟件Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計跨基因內含子的qRT-PCR引物，以Actin基因為內參基因[17]，引物均由長沙北京擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1表1 熒光定量PCR基因引物序列

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序結果主成分與相關性分析主成分分析（PCA）結果（圖1A）顯示，耐鋁毒、鋁毒敏感種質在對照條件下距離較近，而在鋁毒處理下，2個種質距離較遠。樣本間相關性系數(shù)均在0.9以上，相同處理間樣品重復性高，表明測序結果可信度高（圖1B）。

2.2 差異表達TF基因篩選

比較分析處理組與對照組間轉錄組數(shù)據(jù)顯示，耐鋁毒種質南農99-6和鋁敏感種質中豆32中共篩選獲得387個差異表達TF基因（表2）。

這些TF基因分別屬于42個基因家族，其中差異表達數(shù)量較多的TF基因家族有AP2/ERF（51個）、WRKY（46個）、bHLH（39個）MYB（35個）、NAC（32個）、C2H2（20個）、GRAS（12個）、C2C2（11個）AUX/IAA（10個）。

如圖2所示，南農99-6中共檢測到220個差異表達TF基因，其中153個上調表達、67個下調表達；中豆32中共篩選獲得249個差異表達TF基因，123個上調表達、126個下調表達。兩種質間有83個共有TF基因差異表達，其中有59個上調表達、23個下調表達，1個在南農99-6上調表達、在中豆32中下調表達；分別有93個、44個基因僅在南農99-6中上調表達、下調表達，64個、102個基因僅在中豆32中上調表達、下調表達。

表2 TF基因家族統(tǒng)計結果

圖2耐鋁毒與鋁毒敏感種質中差異表達轉錄因子韋恩圖

2.3 差異表達TF基因GO功能富集分析

GO富集分析結果（表3）顯示，在生物過程中2個種質富集到了24個相同的G0條目，其中南農99-6富集在響應幾丁質中的差異表達TF基因最多，有41個，中豆32富集到19個TF基因。兩種質間的差異表達TF基因主要富集在激素響應、激素調控信號通路上，比如赤霉素、水楊酸、茉莉酸等；還富集在細胞壁合成、金屬離子、抑制植物發(fā)育相關生物學過程，如細胞壁組織或生物發(fā)生的調節(jié)、次級細胞壁生物發(fā)生的調節(jié)、細胞內響應金屬離子、細胞內響應鎳離子、種子萌發(fā)負調控、發(fā)育過程的負調控。

表3耐鋁毒與鋁毒敏感種質在生物過程中富集到相同GO條目

2.4 TF基因KEGG富集分析

在耐鋁毒、鋁毒敏感種質中，富集到的前20條KEGG信號通路中有15條相同（圖3），分別為植物激素信號轉導、植物MAPK信號通路、植物-病原菌互作、糖胺聚糖降解、鞘脂類代謝、RNA降解、果糖和甘露糖代謝、戊糖-葡萄糖醛酸轉化、Betalain生物合成、半乳糖代謝、其他聚糖降解、鞘糖脂生物合成-神經節(jié)系列、植物晝夜節(jié)律、戊糖磷酸途徑、氨基糖和核苷酸糖的代謝。

2.5 互作蛋白網絡構建、關鍵TF基因篩選

83個共有差異表達TF基因主要分布在NAC?MYB?WRKY?bZIP?AUX/IAA 等基因家族，其中NAC基因家族數(shù)量最多，占總數(shù)的 13.25% ，其次為WRKY基因家族，占 12.05% （圖4A）。利用STRING在線數(shù)據(jù)庫分析83個轉錄因子的互作關系，篩選出5個關鍵轉錄因子之間存在互作關系（圖4B），其中2個屬于NAC家族，3個屬于WRKY家族，分別為Glyma.12G022700（NAC6）、Glyma.04G223300（WRKY58）、Glyma.17G222300（WRKY30）、Glyma.18G213200（WRKY57）、Gly-ma.15G078300（I1MEN3_SOYBN），見表4。

圖3南農99-6（A）和中豆32（B）中差異表達TF基因的KEGG富集分析

圖4共有差異表達轉錄因子基因分類（A）、蛋白互作圖（B）

2.6 qRT-PCR分析

通過qRT-PCR檢測5個關鍵TF基因響應鋁毒脅迫的表達水平，結果（圖5）表明，與 ^0h 相比，5個基因在鋁毒處理后整體上調表達。其中，NAC6在耐鋁毒種質中先上升后下降，而在敏感種質中則呈現(xiàn)持續(xù)上升；WRKY58、WRKY30、WRKY57在耐鋁毒種質和敏感種質中隨處理時間的延長表達水平持續(xù)增加；I1MEN3_SOYBN在耐鋁毒種質、敏感種質中呈現(xiàn)先上升后下降的表達模式，均在 24h 表達量最高。

圖5鋁毒脅迫不同時間TF基因的表達水平

表45個互作的轉錄因子在STRING中的注釋

3討論與結論

轉錄因子在調控植物應對非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[16，24]。過表達或者敲除Os-bHLH38能夠顯著提高或者降低水稻苗期的耐鹽性[25]；鋅指蛋白 GmZF351 能夠改善大豆的耐鹽和耐干旱性[26]。在鋁毒脅迫中，VuNAR1（NAC轉錄因子）通過提高WAK1（cellwall-associatedreceptorkinase1）的表達水平調控植株細胞壁果膠的代謝影響植株耐鋁毒性[27]；過表達GsMYB10能夠顯著提高轉基因大豆耐鋁毒性[18];在擬南芥中過表達GmABRI（ERF基因）、GsERF1可顯著提高其耐鋁毒性，降低根尖吸附鋁離子含量[15-16]。在本研究中，響應鋁毒脅迫最多的轉錄因子家族為AP2/ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC5類，表明這些轉錄因子在大豆響應鋁毒過程中發(fā)揮著重要作用。與Liu等[28]和Zhao等[29]的研究結果相比較，本研究篩選到的387個TF基因中有13個是與他們共有的差異表達TF基因，其中耐鋁毒種質南農99-6中有7個基因上調表達、1個基因下調表達，鋁毒敏感種質中豆32中有3個上調表達、5個下調表達，Glyma.09G235700（NAC）Glyma.18G213200（WRKY）在2個種質中均呈上調表達模式，Glyma.05G072600（MYB）在2個種質中均呈下調表達模式。此外，Glyma.18G213200 在Liu等[28]和Zhao 等[29]研究結果中均顯著上調表達，表明該基因的上調表達有利于緩解鋁毒害。

植物響應非生物脅迫是一個復雜的調控網絡，在此過程中，有諸多基因相互協(xié)作共同調控植物的抗逆性[30-33]。OsWRKY63 通過抑制Os-WRKY76的表達，降低了OsWRKY76與Os-bHLH148互作后調控水稻耐冷基因OsDREB1B的表達，從而降低水稻的耐冷性[32]。GmERF1 和GmWRKY6協(xié)同調節(jié)大豆的耐低磷性[34]。

CML24、CAMTA2與WRKY46互作緩解WRKY46對ALMT1的轉錄抑制，促進植株分泌蘋果酸，進而提高植株的耐鋁毒性[35]。F-box 蛋白RAE1、RAH1通過調控鋁毒核心轉錄因子STOP1的泛素化和降解影響植物的耐鋁毒性，而 ALR1（LRR receptor-like kinase）可增加植物內的活性氧含量，抑制RAE1與STOP1的互作，降低STOP1的降解，從而激活有機酸陰離子的分泌進行解毒[36-38]。在本研究中，通過蛋白質網絡互作分析發(fā)現(xiàn)在鋁毒脅迫下NAC6、WRKY58、WRKY30、RKY57、I1MEN3_SOYBN這5個轉錄因子之間存在互作關系。已有諸多報道顯示NAC、WRKY基因家族成員的表達能夠顯著影響植物的耐鋁毒性，已報道的基因有 OsNACOI6^[17] 、 VuNARI^[27] 、Gm-（204號 WRKY2I^[39] 、 OsWRKY22^[40] 、WRKY47[41]、Gm-WRKY8I^[42] 等。qRT-PCR 檢測結果顯示，與 ^0h 相比，這5個TF基因隨鋁毒處理時間均顯著上調表達，其中WRKY58、WRKY30、WRKY57在耐鋁毒種質和敏感種質中隨處理時間的延長表達水平持續(xù)增加。WRKY57在耐鋁毒種質科豐1號中隨著鋁毒處理時間的延長表達水平增加，在鋁毒敏感材料GuangfengMaliaodou中則是先上調后下調表達，但是與 0h 相比均顯著上調表達[29]；而Liu等[28]研究表明，該基因則在鋁毒敏感種質Pella中持續(xù)上調表達，與 0h 相比，該基因在耐鋁毒種質和鋁毒敏感種質均顯著上調表達。由此表明，WRKY57在大豆響應鋁毒過程中有著重要的調控作用，但具體調控機理以及該基因是否與WRKY30、IIMEN3_SOYBN互作共同調控大豆耐鋁毒性均需進一步驗證。

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