滇水金鳳花距發育相關基因MADS-EJ2 和MADS2的克隆及表達分析

中圖分類號：S681.1：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）09-0001-08

Cloning and Expression Analysis of MADS-EJ2 and MADS2 Genes Related to Spur Development in Impatiens uliginosa

Wang Tianye， Yang Mengqing，Ma Hui， Liang Guangrong， Huang Meijuan， Huang Haiquan （College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences，Southuest Forestry University/Researchand Development Center ofLandscape Plants and HorticultureFlowers，Southwest Forestry University，Kunming 65O224，China）

AbstractSEPALLATA（ SEP ）-like，a class E MADS-box transcription factor gene， plays a key role in development of flower organs. In order to investigate the function of SEP -like gene in the spur development of Impatiens uliginosa，the genes MADS-EJ2 and MADS2 were successfully cloned in the present study，named IuMADS-EJ2 and IuMADS2，and both of them had a cDNA sequence length of 762 bp and encoded for 253 amino acids.Bioinformatic analysis demonstrated that IuMADS-EJ2 was a hydrophilic stable protein，and IuMADS2 was a hydrophilic unstable protein，both of them contained MIKC structure and had their sub-familyspecific SEPI and SEP I motifs at C terminus，which were class E genes.Subcelular localization predicted that IuMADS-EJ2 and IuMADS2 were located in nuclei. The amino acid sequences of IuMADS-EJ2 and IuMADS2 genes were both clustered with the homologous gene of Impatiens glandulifera with the similarity of （204號 98.03% and 95.26% respectively. The qRT-PCR analysis indicated that both the two genes expressed at three development periods and two different parts of I . uliginosa spur. IuMADS-EJ2 expressed the highest in the petal spur at the early stage，and IuMADS2 expressed the highest in the limb at the early stage.It was speculated thatthe two genes regulate the development of petal spur，especially at the early stage of petal spur development.The results could provide theoretical bases for the development mechanism analysis of petal spur，the improvement of flower form and the new variety cultivation of Impatiens.

KeyWordsImpatiens uliginosa; Petal spur development ; MADS-EJ2 gene; MADS2 gene; Bioinformatics analysis ； Expression analysis

花距是指在某些植物的花中，其花瓣、萼片等向后或側面延伸成管狀或囊狀的結構[1]。這種特殊結構對傳粉者的訪花效率有潛在影響[2]花距的長度隨著環境不斷演變，以使植物能適應新的傳粉者，造成生殖隔離，形成新物種[3]，因此花距被認為是被子植物演化過程中的“關鍵創新性狀”之一[4]。為探究花距發育機制，研究者對紅排草和樓斗菜等植物花距進行研究，發現細胞的各向異性擴張是花距伸長的主要原因[5-6]Edwards等[7發現樓斗菜彎距的近端和遠端表面的差異生長主要是由細胞分化驅動的，而直距是通過增加距表面之間的差異細胞伸長進化的。然而，Tsai等[8]對兩種天竺葵的研究發現，花距的最終長度取決于花托生長速度和發育時間。鑒于這些都是花距獨立進化的不同系統，在不同系統中花距的發育和種間變異可能是由不同機制驅動的。

MADS-box轉錄因子（MADS-box TFs）是迄今已知植物中最多的基因家族之一[9]?；贛ADS結構域的序列保守性，分為I型（SRF樣）和Ⅱ型兩個主要譜系，其中Ⅱ型MADS-box基因功能研究更為充分，已明確其對花分生組織及花器官發育具有關鍵性的作用[10]。MADS-box 基因在進化過程中廣泛復制而形成獨特的、系統發育高度保守的亞家族[1]。如LOFSEP進化系細分為SEP1/2、FBP9和SEP4三個單元組[1]，而LOFSEP和SEP3兩個進化系是由E類MADS-box 蛋白演變而來的[13]。為探究E類基因在花器官身份確定中的作用，Kaufmann等[14]研究了SEPALLATA-like（SEP-like）基因在擬南芥花發育中的作用，發現SEP-like通過調節生長素生物合成途徑促進花器官的生長和形態發生。擬南芥中過表達MADS2導致花期提前和小萼片產生[15]

Yadav等[16]研究水稻中OsMADS2基因在小葉發育中的作用，發現其通過調節編碼預測轉錄因子和細胞周期調節因子等控制細胞分裂和分化。在番茄中通過CRISPR/Cas9技術獲得EJ2（EN-HANCEROFJOINTLESS2）基因的功能突變體（ej2^cR） ），發現這些突變體的花序沒有分枝，但花萼異常大，即 MADS-EJ2與 J2 基因及其他MADS-box家族基因相互作用，形成了調控花序分枝和花朵發育的冗余網絡[17-18]。綜上所述，MADS-box家族基因可能通過調控細胞分裂和分化或調節生長素等激素途徑調控花器官發育。

滇水金鳳（Impatiensuliginosa）是鳳仙花科（Balsaminaceae）鳳仙花屬（Impatiens）一年或多年生植物，主要分布于、貴州等地，生長于林下等潮濕處，具有生長快、周年開花、抗逆性強等特性。此外，其多樣的花色、奇特的花距結構為專家學者開展鳳仙花屬植物的研究提供了寶貴的試驗材料。到目前為止，關于MADS-box家族基因對鳳仙花花距發育的調控機制尚未見報道。本研究在分離并克隆出滇水金鳳的 IuMADS-EJ2 和Iu-MADS2基因基礎上，對其序列結構和系統進化進行分析，同時利用qRT-PCR方法對滇水金鳳花距發育不同時期（花苞期、始花期和盛花期）及不同部位（檐部和距部）的 IuMADS-EJ2 和Iu-MADS2的時空表達模式進行分析，以期為進一步探究滇水金鳳花距發育的分子機理奠定基礎

1材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以西南林業大學樹木園滇水金鳳為研究對象，于2023年7月采集其花苞期（S1）、始花期（S2）盛花期（S3）花距的檐部和距部（圖1），存放于 -80°C 冰箱中備用。

圖1滇水金鳳花距的3個發育時期及其檐部和距部

1.2總RNA的提取與 IuMADS-EJ2 和IuMADS2 基因的克隆

使用植物總RNA提取試劑盒（Omega）對滇水金鳳花距的總RNA進行提取，用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，于 -20^°C 保存。以滇水金鳳花距轉錄組中的 IuMADS-EJ2 和IuMADS2為依據設計擴增其全長的特異性引物（IuMADS2：上游引物序列為 5^′ -ATGGGAAGGGGAAGAGTT-GAAC - 3^′ ，下游引物序列為 5^′ - TTACAG-CATCGATATCCAACCTGG- 3^′ ： IuMADS-EJ2 ：上游引物序列為 5^′ -ATGGGTAGAGGGAGAGTTGAGT-TGAAGAGG- ?3^′ ，下游引物序列為 5^′ -TCAAAGCGACCACCCCGGAACAAAC-3'）。以得到的cDNA作為模板進行PCR擴增， 20μL PCR擴增體系包括cDNA 1μL 、IuMADS-EJ2/IuMADS2上游引物1μL?IIuMADS-EJ2/IuMADS2 下游引物 1μL ，dNTP Mixture 10μL ，dd H₂O7μL 。擴增程序：94^°C 預變性 2min ： 94^9C 變性30 s， 60^°C （ Iu. MADS-EJ2^? 或 57^°C （IuMADS2）退火 30s，72‰ 延伸 1min，35 個循環; 72^°C 延伸 5min 。通過凝膠電泳獲得目的條帶，經回收純化后與pMD19-T載體連接，轉化 DH5α 感受態細胞，挑選陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 IuMADS-EJ2和IuMADS2基因生物信息學分析

運用Expasy軟件分析 IuMADS-EJ2 和Iu-MADS2基因編碼蛋白的基本理化性質；利用NC-BIConserved Domain Database 對 IuMADS-EJ2和IuMADS2蛋白結構域進行預測；采用WoLFPSORT軟件預測IuMADS-EJ2和IuMADS2蛋白的亞細胞定位;利用SWISS-MODEL對IuMADS-EJ2及IuMADS2進行三維空間結構模擬；利用BLAST、DNAMAN9.O 及 MEGA-X 對IuMADS-EJ2和IuMADS2序列進行比較，并構建系統進化樹

1.4 IuMADS-EJ2和IuMADS2基因時空表達模 式分析

分別提取滇水金鳳S1、S2、S3時期花距檐部和距部的RNA，反轉錄合成cDNA。設計IuMADS-EJ2和IuMADS2的qRT-PCR引物，以IuActin作為內參基因[19]，引物序列見表1。每個樣品重復3次，用 2^-ΔΔGt 法計算 IuMADS-EJ2 和 IuMADS2基因在3個時期和2個部位的相對表達量

表1 IuMADS-EJ2 和 IuMADS2 基因 qRT-PCR 引物

2 結果與分析

2.1 滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2基因的 克隆

通過PCR擴增，獲得 IuMADS-EJ2 和Iu-MADS2基因的cDNA全長序列，均為 762bp ，均編碼253aa（圖2）。

2.2 滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2基因編 碼蛋白的序列和結構分析

如表2所示，IuMADS-EJ2為穩定蛋白，Iu-MADS2為不穩定蛋白：IuMADS-EJ2和IuMADS2均屬親水蛋白，無信號肽和跨膜結構域，且均定位于細胞核內。如圖3所示，IuMADS-EJ2和 Iu-MADS2均具有MADS-box蛋白典型的MADS區和K區，推測其為MIKC型MADS-box蛋白；Iu-MADS-EJ2和IuMADS2蛋白均包含 α- 螺旋、延伸鏈、 β 折疊和無規則卷曲4種結構，其高級結構均以 ∝ -螺旋為主。

圖2滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2 基因cDNAPCR擴增結果

M：DL200OMarker;1：IuMADS-EJ2;2：IuMADS2。

2.3 滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2基因的系統進化分析

如圖4所示，IuMADS2與喜馬拉雅鳳仙花IgMADS2、矮牽牛PhFBP5、煙草NaSEP1、番茄SISEP1、辣椒CaSEP1聚類為一支;IuMADS-EJ2與喜馬拉雅鳳仙花IgMADS-EJ2、矮牽牛PhFBP9、三葉裂薯ItbMADS-EJ2、矮牽牛PhFBP23、辣椒CaCMB1、黃燈籠辣椒CcAGL3、番茄SIMADS-EJ2聚類為一支。IuMADS2 和Iu-MADS-EJ2雖聚類在一個大分支，但分別屬于SEP1/2 和 FBP9 進化系。IuMADS-EJ2 和 Iu-MADS2蛋白與喜馬拉雅鳳仙花同源序列相似性分別為 98.03% 和 95.26% ，且都具有MADS-box基因家族典型的MIKC結構，在C-末端區域具有保守的SEPI和SEPⅡ基序。這些結果表明MADS-box轉錄因子在一些區域是保守的，因此推測滇水金鳳 IuMADS-EJ2 和IuMADS2功能可能與其他物種的同源基因類似。

表2滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2蛋白的理化性質

圖3滇水金鳳IuMADS-EJ2（A）和IuMADS2（B）的保守結構域及蛋白質三級結構

圖4滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2蛋白系統發育樹（A）及與其他物種同源氨基酸序列比對（B）

2.4 滇水金鳳IuMADS-EJ2和IuMADS2基因的 時空表達分析

滇水金鳳花距發育過程中， IuMADS-EJ2 和IuMADS2基因在S1、S2、S3時期的檐部和距部均有表達（圖5）。在檐部， IuMADS-EJ2 的表達呈先升高后降低的趨勢，在S2時期表達量最高，顯著高于其余時期，且顯著高于此期在花距中的表達量（ Plt;0.05） ；而在距部，IuMADS-EJ2的表達呈逐漸降低的趨勢，S1時期的表達量最高，不僅與S2、S3時期的表達量差異顯著（ Plt;0.05） ，且顯著高于其在各期檐部中的表達量。IuMADS2在檐部和距部中的表達均呈逐漸降低的趨勢，且各時期檐部的表達量均高于距部，并在S1時期差異達顯著水平（ Plt;0.05） 。綜上推測 IuMADS-EJ2 和 Iu MADS2基因參與調控滇水金鳳的花距發育，并且主要在花距發育初期發揮作用

S1：花苞期;S2：始花期;S3：盛花期。柱上不同小寫字母表示不同時期不同部位間差異顯著（ Plt;0.05） 0圖5IuMADS-EJ2（A）和IuMADS2（B）基因在滇水金鳳發育過程中的時空表達模式

3討論與結論

MADS-box轉錄因子是植物生殖發育的關鍵調節因子，除了在花器官身份確定中發揮關鍵作用外，其對開花時間控制、花序結構、花粉發育、種子/果實發育和根系發育都起著特別突出的作用[20]。MADS-box 家族基因分為A、B、C、D 和E類，其中E類基因（SEP基因）在MADS-box蛋白復合物的形成中充當橋梁[21]。如Pelaz等[22]發現B和C類基因的活性依賴于三個功能冗余且密切相關的 MADS-box家族基因 SEP1、SEP2、SEP3的協同作用。本研究從滇水金鳳中成功分離并克隆了IuMADS-EJ2和IuMADS2基因，cDNA全長均為 762bp ，均編碼 253 aa，與草莓[23]FaMADS2、菠蘿 ^[24]AcMADS2 、番茄[17]EJ2存在差異，表明其具有物種特異性。IuMADS2蛋白為親水性不穩定蛋白，無信號肽和跨膜結構，二級結構以 ∝ -螺旋為主，與芍藥MADS2蛋白的分析結果一致[25]。IuMADS2 定位在細胞核內，與小麥TaMADS2的亞細胞定位分析結果一致[26]。Iu-MADS2蛋白的序列結構中存在保守的MADS區和K區，與肖翔等[27]研究的黃肉桃PpMADS2蛋白的結果一致，表明IuMADS2是MIKC型的MADS-box家族基因。對IuMADS-EJ2蛋白進行分析發現，其與石竹DcSEP1蛋白的分析結果一致，均為親水性穩定蛋白，二級結構均以 ∝ -螺旋為主[28]，與辣椒CaSEP5的亞細胞定位分析結果一致，也定位在細胞核中[29]。多序列比對分析結果表明IuMADS-EJ2蛋白具有MIKC結構域，在C-末端有 SEPI和SEPⅡ基序，與Lin等[30]在蘭花中鑒定的SEPALLATA相似，說明IuMADS-EJ2為MIKC型 MADS-box 基因，且可能是LOFSEP進化系中的FBP9單元組。系統進化分析顯示IuMADS2和IuMADS-EJ2均屬于E類MADS-box蛋白，分別與喜馬拉雅鳳仙花IgMADS2 和Ig-MADS-EJ2親緣關系最近;IuMADS2和IuMADS-EJ2蛋白處于同一個分支，但分屬于SEP1/2和FBP9分支，推測 SEP-like 基因可能通過基因復制、可變剪切等方式產生功能趨異、新功能、亞功能的旁系同源基因[31]。滇水金鳳中是否存在SEP-like基因的其他旁系同源基因在花器官發育過程中發揮功能還有待進一步研究。

MADS-box家族基因的廣泛復制形成獨特的、系統發育高度保守的亞家族，同一個亞家族內的基因可能具有相同的功能[32]。辣椒CaSEP5屬于FBP9/23亞分支，在花器官的花序中表達，但在萼片和花瓣中表達量相對較高，而且將其沉默后其他花同源基因的表達模式和激素水平都發生改變[29]；石竹[28]FBP9/23分支成員DcMADS7和矮牽牛[33]PhFBP9/23在萼片和花瓣中表達，在雄蕊中不表達；羽衣甘藍BroaSEP1/2/3均在花器官發育初期顯著高表達[31]。這表明SEP-like基因在花分生組織分化和花器官形成中發揮重要作用。本研究結果表明，IuMADS2和IuMADS-EJ2在滇水金鳳花距的不同發育階段和不同部位中都有表達，且總體在花距發育初期高水平表達，這與番茄[34]SICMB1的表達模式相似，推測IuMADS2和 IuMADS-EJ2 主要在花距發育早期起作用，在始花期和盛花期的伸長生長可能由其他旁系同源基因調控。 SEP-like 基因在不同的被子植物家族中還發揮著不同的作用，如苞片形狀、花梗脫落區大小、花萼大小和花序結構的調節，說明其可能具有更大的功能靈活性，能夠實現新的功能化[35]

綜上，本研究克隆了滇水金鳳的IuMADS-EJ2和IuMADS2基因，兩者均具有MADS-box家族典型的結構域，同屬E類基因，C端都有其亞家族特異的SEPI和SEPⅡ基序，但分屬SEP1/2和FBP9亞支。兩基因均參與滇水金鳳花距的發育，且主要在花距發育初期發揮作用，但具體調控機理尚不清楚。本研究結果可為探究滇水金鳳花距發育機制奠定基礎，同時為鳳仙花的花形改良和新品種培育提供一定的基礎數據和理論依據。

參考文獻：

[1] Vlasánková A，Padysáková E，BartosM，et al. The nectar spur isnot only a simple specialization for long-proboscid pollinators [J].NewPhytologist，2017，215（4）：1574-1581.

[2] HodgesSA，FultonM，YangJY，etal.VerneGrantand evolutionary studiesof Aquilegia[J].New Phytologist，2O04，161 （1）：113-120.

[3] Minelli A. Species diversity vs.morphological disparity in the lightof evolutionary developmental biology[J]. Annals of Botany，2016，117：781-794.

[4] Fernández-MazuecosM，Blanco-PastorJL，JuanA，etal.Macroevolutionary dynamicsofnectar spurs，a keyevolutionaryinnovation[J].New Phytologist，2019，222（2）：1123-1138.

[5] MackJLK，DavisAR.Therelationshipbetweencell division and elongation during development of the nectar-yielding petal

[6]Puzey JR，Gerbode S J，Hodges S A，et al. Evolution of spurlength diversity in Aquilegia petals isachieved solely through cellshape anisotropyJ].Proceedingsof theRoyal Society， 2011，279（1733） ：1640-1645.

[7]Edwards M B，Ballerini E S，Kramer E M. Complex developmental and transcriptional dynamicsunderlie polinator-driven evolutionary transitions in nectar spur morphology in Aquilegia （columbine）[J]. American Journal of Botany，2022，109（9）： 1360-1381.

[8]Tsai T，Diggle P K，Frye H A，et al. Contrasting lengths of Pelargonium floral nectar tubes result from late differences in rate and duration of growth[J].Annals of Botany，2018，121（3）： 549-560.

[9]Zhou E Q，Zhang Y，Wang H D，et al. Identification and characterization of the MIKC-type MADS-box gene family in Brassica napus and its role in floral transition[J].International Journal of Molecular Sciences，2022，23（8） ：4289.

[10] Kapazoglou A，Engineer C，Drosou V，et al. The study of two barley type I-like MADS-box genes as potential targets of epigenetic regulation during seed development[J]. BMC Plant Biology，2012，12：166.

[11]TheiBen G，Kim JT，Saedler H. Clasification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADSbox gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes [J]. Journal of Molecular Evolution，1996，43（5） ：484-516.

[12] Zhou Y Z，Xu Z D，Yong X，et al. SEP-class genes in Prunus mume and their likelyrolein floral organ development[J]. BMC Plant Biology，2017，17（1） ：10.

[13] Zahn L M，Kong H Z，Leebens-Mack JH，et al. The evolution of the SEPALLATA subfamily of MADS-box genes： a preangiosperm origin with multiple duplications throughout angiosperm history[J]. Genetics，2005，169（4）：2209-2223.

[14] Kaufmann K，Muino JM，Jauregui R，et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3 ： integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower[J]. PLoS Biology，2009，7（4） ：e1000090.

[15]Wei B，Liu D M，Guo JJ，et al. Functional divergence of two duplicated D-lineage MADS-box genes BdMADS2 and BdMADS4 from Brachypodium distachyon[J]. Journal of Plant Physiology，2013，170（4） ：424-431.

[16]Yadav S R，Prasad K， Vijayraghavan U. Divergent regulatory OsMADS2 functions control size，shape and differentiation of the highly derived rice floret second-whorl organ[J]. Genetics， 2007，176（1） ：283-294.

[17] Soyk S，Lemmon Z H，Oved M，et al. Bypassing negative epistasis on yield in tomato imposed by a domestication gene[J]. Cell，2017，169（6） ：1142-1155.

[18] Soyk S，Lemmon Z H，Sedlazeck F J，et al. Duplication of a domestication locus neutralized a cryptic variant that caused a breeding barrier in tomato[J]. Nature Plants，2019，5（5） ：471- 479.

[19］魏春梅，孟丹晨，李凡，等.滇水金鳳花距發育相關基因 ABP的克隆及表達分析[J].廣西植物，2023，43（6）：1051- 1058.

[20]Smaczniak C，Immink RG，Angenent G C，et al. Developmental and evolutionary diversity of plant MADS-domain factors：insights from recent studies[J]. Development，2012，139（17）： 3081-3098.

[21]Arora R，Agarwal P，Ray S，et al. MADS-box gene family in rice：genome-wide identification，organization and expression profiling during reproductive development and stress[J].BMC Genomics，2007，8：242.

[22]Pelaz S，Ditta G S，Baumann E，et al.B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes[J]. Nature，2000，405（6783） ：200-203.

[23］董佳樂.草莓FaMADS1和FaMADS2基因的克隆、鑒定和功 能初探[D].合肥：安徽農業大學，2019.

[24］楊祥燕，蔡元保，張治禮，等.菠蘿MADS-box基因AcMADS2 的克隆與表達分析[J].植物生理學報，2016，52（9）：1406- 1412.

[25]吳彥慶，湯寓涵，趙大球，等.芍藥內外花瓣發育形成相關 基因片段的生物信息學及組織表達分析[J].中國農業大 學學報，2017，22（12）：53-63.

[26］韓迎春.小麥轉錄因子TaMADS2參與磷脅迫響應的機制 及其功能研究［D].鄭州：河南農業大學，2022.

[27]肖翔，周儲江，金舒婉，等.PpMADS2與PpMADS3協同調控 黃肉桃果實類胡蘿卜素積累機制的研究［J].園藝學報， 2023，50（6） ：1173-1186.

［28］李丹丹.石竹花發育E類基因的克隆及功能分析［D].武 漢：華中農業大學，2024.

[29]Guo JJ，Cheng Q，Sun L，et al. The SEPALLATA-like CaSEP5 gene regulates flower sepal，pedicel，and fruit development in pepper（Capsicum annuum L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2024，330：113100.

[30]Lin Z Y，Zhu GF，Lu CQ，et al.Functional conservation and divergence of SEPALLATA-like genes in floral development in Cymbidium sinense[J]. Frontiers in Plant Science，2023，14： 1209834.

[31］相元萍，黃云彤，賀洪軍，等.羽衣甘藍SEPALLATA-like基 因的系統發育與表達分析[J].生物工程學報，2020，36 （11） ：2398-2412.

[32]Becker A，TheiBen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogeneticsand Evolution，2003，29 （3）：464-489.

[33]Ferrario S，Immink RG，Shchennikova A，et al. The MADS box gene FBP2 is required for SEPALLATA function in petunia[ J]. Plant Cell，2003，15（4） ：914-925.

[34]ZhangJL，Hu ZL，WanY S，et al.Suppression of a tomato SE PALLATA MADS-box gene，SlCMB1，generates altered inflorescence architecture and enlarged sepals[J].Plant Science， 2018，272：75-87.

[35]Dreni L，FerrándizC.Tracing the evolution of the SEPALLATA subfamily across angiosperms associated with neo-and subfunctionalization for reproductive and agronomically relevant traits[J].Plants，2022，11（21） ：2934.