低共熔溶劑對偏甘油酯脂肪酶LipaseG50活性和穩定性的影響

中圖分類號：Q814 文獻標志碼：A

Abstract：This study aims to investigate the effects deep eutectic solvents（DESs） on the activity stability partial glyceride lipase Lipase G5O.By preparing 21 different types DESs，the correlations between the physicochemical properties DESs their components were explored，along with the influence patterns various DESs on the activity stability Lipase G5o.The results demonstrate that the prepared DESs primarily form through hydrogen bond interactions. Their acidity or alkalinity is determined by the component with stronger proton-donating or proton-accepting capabilities，while polarity is mainly governed by hydrogen bond acceptors （HBAs）.Lipase G5O exhibited good acid-base tolerance in DESs but lost activity in highly polar or strongly acidic environments.Enzyme activity significantly decreased when viscosity exceeded 10 000mPa?s. Urea-based proline-based DESs notably enhanced both the activity thermal stability Lipase G5O. This research provides a theoretical basis for the application Lipase G5O in DES-mediated catalytic oil modification.

Key words：deep eutectic solvents （DESs）； Lipase G5O；activity； stability； physicochemical properties

0 引言

隨著綠色化學和可持續發展理念的不斷推進，傳統有機溶劑因存在毒性大、揮發性強、環境污染等問題，逐漸無法滿足現代工業對綠色、環保的要求.因此，開發新型綠色溶劑成為化學和生物催化領域的研究熱點.2003年，Abbott等[1，2]首次發現氯化膽堿-尿素的低共熔現象并提出了低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）的概念.DESs是由氫鍵供體（HBDs）和氫鍵受體（HBAs）按照一定摩爾比混合形成的液體混合物，其熔點顯著低于單一組分的熔點.這類溶劑因其獨特的物理化學性質，如低揮發性、高溶解性、可調性和環境友好性，逐漸成為傳統有機溶劑和離子液體的理想替代品，尤其是在綠色化學和可持續化學領域.

近年來，DESs在生物催化領域的應用受到廣泛關注.Choi等[3]于2011年提出了天然低共熔溶劑的概念，其組分完全來源于生物體內小分子代謝物，如膽堿衍生物、醇類、有機酸、糖類等，這些天然組分不僅具有低毒性、生物可降解性和環境友好性，還能夠通過氫鍵等相互作用形成低共熔混合物，從而顯著降低溶劑的熔點.這一概念的提出進一步拓展了DESs在生物催化中的應用前景，尤其是在酶催化反應中的應用.

研究表明，DESs能夠顯著提高某些生物酶（如脂肪酶）的活性與穩定性.脂肪酶是一類重要的生物催化劑，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品和生物柴油等領域.DESs通過其獨特的溶劑特性，如高極性、低揮發性和良好的溶解性，能夠為酶提供一個適宜的微環境，從而增強酶的催化效率和穩定性.例如，DESs中的氫鍵網絡可以穩定酶的構象，減少酶在非水相環境中的失活.此外，DESs還能夠通過調節反應介質的極性和粘度，影響底物和產物的擴散速率，進而優化反應條件[4].然而，目前關于DESs中脂肪酶活性和穩定性的研究大多集中在甘油三酯脂肪酶上，而對于偏甘油酯脂肪酶的研究相對較少.偏甘油酯脂肪酶是一類具有特殊甘油酯選擇性的酶，其僅能催化合成或水解甘油單酯和甘油二酯，而不能合成或水解甘油三酯.因其獨特的甘油酯選擇性，目前，偏甘油酯脂肪酶被廣泛應用于功能性結構脂質（甘油二酯、甘油三酯型PU-FA等）丙二醇脂肪酸酯的制備，并被廣泛應用于高酸價油脂的酶法脫酸和植物油的酶法脫膠中[5].

然而，目前關于低共熔溶劑中偏甘油酯脂肪酶活性和穩定性的研究尚未有報道.

LipaseG5O作為唯一一種市售的偏甘油酯脂肪酶，具有重要的工業應用價值.然而，關于其在DESs中的活性和穩定性的研究鮮有報道[.因此，本研究旨在通過制備多種不同類型的DESs，系統研究其理化性質（如極性、pH、密度、水分活度、粘度等）對LipaseG5O活性和穩定性的影響，以期為LipaseG5O和DESs在生物催化領域的應用提供理論依據和技術支持.

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

氯化膽堿（分析純），甜菜堿（分析純）脯氨酸（分析純），乳酸（分析純），甘油（分析純），乙二醇（分析純），檸檬酸（分析純），尿素（分析純），葡萄糖（分析純），LipaseG5O商品化脂肪酶（日本天野酶制劑公司），溴化鉀（光譜純），尼羅紅染料（分析純），氫氧化鈉（分析純），聚乙烯醇（分析純）， 95% 乙醇（分析純）

1.2 主要儀器

傅里葉紅外光譜儀（VECTOR-22），數字式粘度計（NDJ-8S）， pH 計（PHS-3C），紫外可見分光光度計（Evolution200），低溫恒溫槽（DC-0510），水分活度計（HD-3B），旋轉蒸發器（RE-52AA），氣浴恒溫振蕩器（THZ-92C）.

1.3 實驗方法

1.3.1 低共熔溶劑的制備

DESs的制備比例按照表1所示，按一定的摩爾比分別稱取各組分，混合置于 250mL 圓底燒瓶中，于旋轉蒸發器中 80° 水浴旋轉 直至獲得澄清透明液體.由于部分DESs按比例無法形成均一透明液體，而少量水分不會對低共熔溶劑性質造成巨大影響，因此制備過程中按比例加人一定量的去離子水.

1.3.2 傅里葉紅外光譜測定

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）技術對低共熔溶劑（DESs）及其組分進行表征.具體操作如下：首先將干燥的溴化鉀研磨成粉末，并將其壓制成薄片.隨后，將少量DESs均勻涂抹于溴化鉀薄片表面.將樣品放入傅里葉變換紅外光譜儀中進行掃描，掃描范圍設定為 500～4000cm^-1 ，掃描次數為15次，分辨率設置為 0.07cm^-1.

表1低共熔溶劑的組成及摩爾比

1.3.3 極性測定

參照Juric等8的方法并加以改進，尼羅紅染料的最大吸收波長會因溶劑極性的不同而發生顯著變化，因此可以通過測定尼羅紅在不同溶劑中的最大吸收波長來間接反映溶劑的極性.本研究采用以下方法進行測定：首先，使用 96% 乙醇配制濃度為 5mmol/L 的尼羅紅溶液.然后，將980μL 的低共熔溶劑（DESs）與 20μL 尼羅紅乙醇溶液混合均勻，制備成測試樣品.接著，利用紫外-可見分光光度計在 400～700nm 波長范圍內測定樣品的最大吸收波長.根據公式（1）計算溶劑的極性值：

E_NR=28 591λ_max^-1

1.3.4 物理性質測定

（1）pH 測定

采用 pH 計對配置的DESs的 ΔpH 進行測定，各種樣品測定三次，結果取平均值.

（2）密度測定

DESs的密度參考鐘小榮9的方法采用密度瓶法進行測定，具體測定步驟如下：首先用乙醇、乙醚依次清洗密度瓶，待完全干燥冷卻到室溫后置于分析天平上稱量并記錄質量；然后倒滿蒸餾水，置于低溫恒溫槽中 20°C 條件下浸泡，待水溫到達20° 后取出，擦拭干水分后置于分析天平上稱量并記錄質量，計算出 20° 時蒸餾水的質量；倒出蒸餾水瀝干水分后再倒滿待測DESs樣液，重復上述操作，計算出 20°C 時待測樣液的質量.相對密度按照公式（2）計算：

式（2）中： m₁ 為 20° 時密度瓶裝滿DESs的質量 （g）;m₂ 為 20°C 時密度瓶裝滿蒸餾水的質量（g）；0.9982為 20°C 時水的密度 （g/cm³） ：

（3）水分活度測定

DESs的水分活度使用水分活度儀進行測定.具體測定方法如下：在測定DESs樣品的水分活度之前，首先使用無水硅膠進行三次預測定以校準儀器.隨后，將DESs樣品均勻鋪展在塑料樣品血中，將樣品血放置于水分活度儀的傳感器底座上，并蓋上傳感器進行測定.每次測定持續 5min ，每個樣品重復測定三次，最終取三次測定結果的平均值作為該樣品的水分活度值.

（4）粘度測定

DESs的粘度使用數字式粘度計進行測定.具體測定方法如下：將一定量的低共熔溶劑（DESs）移取至 50mL 塑料離心管中，隨后利用恒溫水浴鍋對DESs樣品進行加熱處理.在測量之前，先對粘度計進行校準操作，以確保測量的準確性.根據所測DESs的特性，選擇合適的轉子和轉速，將轉子浸入DESs中，直至液面達到轉子的刻度線.啟動粘度計進行測量，待讀數穩定后記錄數據.

1.3.5 偏甘油酯脂肪酶LipaseG5O水解活力的測定

采用甘油二酯乳化法測定LipaseG5O的水解活力[10].具體操作如下：先將 4% 的聚乙烯醇與甘油二酯按照質量比 3：1 的比例混合，用均質機均質乳化 3min 左右，靜置 3min 后再繼續均質3min 左右，直至乳化液呈乳白色且無油滴為止.然后，在 25mL 錐形瓶中加入 4g 乳化液和 pH5.6 的磷酸鹽緩沖液（PBS），于 30^°C 的恒溫振蕩器中預熱 5～10min ，準確加入 0.01g 的LipaseG50酶粉重新放回恒溫振蕩器中并開始計時，反應5min 后取出并立即加入 12g95% 乙醇終止反應，最后滴加1滴 1% 酚酞試劑，采用 0.1mol/L NaOH溶液進行滴定，準確記錄NaOH消耗的體積.空白組不加酶粉，其他操作同前.

脂肪酶水解酶活定義為：在上述測定條件下，每分鐘水解甘油二酯產生 1μmol 脂肪酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）.水解活力按照公

式（3）計算：

脂肪酶水解酶活 （U/g）=

式（3）中： V₁ 為實驗組滴定結束后消耗的ΔNaOH 溶液體積 （mL ）； ΔV₂ 為空白組滴定結束后消耗的NaOH溶液體積 （mL）;c 為NaOH溶液濃度（mol/L） ； m 為反應加入的酶粉質量 Π（g）_σ;t 為反應的時間（ ：

1.3.6 低共熔溶劑中LipaseG5O水解活力的 測定

將 4g 低共熔溶劑（DESs）與等質量乳化液混合.將混合物置于 30^°C 的恒溫振蕩器中預熱 5～ 10min .隨后，加入 _0.01g LipaseG50酶粉，重新將錐形瓶放回恒溫振蕩器中，并開始計時.反應進行 5min 后，迅速取出錐形瓶，并立即加入 12g 95% 乙醇以終止反應.最后，通過滴定法測定酶的活性.乳化液的配制方法以及酶活的測定步驟均參照第1.3.5節的描述進行.

1. 3.7 低共熔溶劑中LipaseG5O熱穩定性測定

稱取適量酶粉置于DESs中，分別在 30° 、 下孵育 ^2h ，再按照1.3.5節方法測定水解活力.

1.3.8 數據處理

每組實驗設定三次平行，使用SPSS對實驗數據進行處理和分析，結果以平均值 ± 標準差表示，Plt;0.05 表示差異具有統計學意義.

2 結果與討論

2.1低共熔溶劑的制備

氯化膽堿和甘油作為最早發現的低共熔溶劑（DESs）組分，因其來源安全、成本低、工藝綠色，被廣泛用于促進酯化、轉酯化等反應，并對酶活性有保護和促進作用.Gutiérrez等[11]發現，酵母細胞在氯化膽堿-甘油體系中低溫凍干后仍能保留大部分活性.甜菜堿作為天然生物小分子，廣泛存在于生物體內，能調節滲透壓并保護蛋白質結構，其形成的DESs在生物酶催化領域有大量報道.盡管尿素會破壞酶蛋白活性，但與甜菜堿結合形成DESs后，卻能穩定酶蛋白結構，這與氫鍵供體（HBDs）和氫鍵受體（HBAs）的分子作用密切相關.Chen等[12]證明，在甜菜堿-尿素體系中，甜菜堿優先與溶菌酶作用，阻止了尿素對酶蛋白的破壞.氨基酸因結構與甜菜堿類似，也被用于DESs的制備[13].Freitas等[14]發現，乳酸-甘油體系中脂肪酶活性顯著提升，表明乳酸在DESs制備中具有應用潛力，

低共熔溶劑（DESs）的制備方法主要有研磨法、冷凍干燥法和加熱法.研磨法在常溫下進行，避免溫度影響，制備的DESs純度高，但吸濕性組分（如氯化膽堿）易因長時間研磨吸水.冷凍干燥法可加速溶解，但操作復雜且設備要求高.加熱法是常見方法，將組分混合后在 80° 旋轉蒸發至澄清液體，操作簡便且性質穩定，適合實驗室制備.Florindo等[15]比較研磨法和加熱法，發現二者制備的DESs物理性質差異不大.

目前，DESs的制備主要以氯化膽堿、甜菜堿、甘油、尿素為主，為進一步豐富其他類型DESs的應用，本文按照1.3.1節中方法選用均來源天然的生物小分子的氯化膽堿和甜菜堿（膽堿類）、甘油和乙二醇（醇類）、檸檬酸和乳酸（有機酸類）、脯氨酸（氨基酸類）、尿素（酰胺類）、葡萄糖（糖類）作為DESs組分，采用加熱法制備了21種DES.

2.2低共熔溶劑FI-IR表征

目前的相關研究DESs的制備過程未涉及傳統意義上的化學反應，各組分（如氫鍵受體HBAs與氫鍵供體HBDs）通過物理作用形成均相體系，且在混合后仍保持其化學本質的獨立性.針對DESs在常溫下由固態原料形成穩定液態的獨特現象，研究者提出了三類理論機制：其一為“內部簇結構理論”，主張原料組分在微觀層面通過自組裝形成動態簇狀結構，從而破壞原有晶格；其二，認為物理混合過程中機械能的輸入導致分子間距改變，促使相態轉變；而最具影響力的解釋來自DESs領域奠基人Abbot團隊提出的“氫鍵協同作用理論”，其核心觀點是HBAs（如氯化膽堿）與HBDs（如甘油、尿素）間形成高強度氫鍵網絡，顯著降低體系的晶格能，導致混合物的共熔點遠低于單一組分熔點.由于甘油基DESs性質比較穩定，針對其與不同氫鍵受體（HBAs）復配時粘度顯著差異的特性，并結合目前糖基DESs基礎數據匱乏的現狀，系統篩選制備了六種具有代表性的DESs體系，通過FT-IR對比分析其氫鍵相互作用特征及組分結構變化規律.

圖1（a）展示了氯化膽堿-甘油及其兩種單一組分的紅外光譜.結果表明，氯化膽堿-甘油中未出現額外的特征峰，說明混合后未發生化學反應生成新物質.然而，羥基振動峰從單一組分的 3579cm^-1 下移至 3541cm^-1 ，且峰強度增強、峰形變寬.C-H伸縮振動峰 （2800～2900cm^-1） 和伯醇吸收峰（ 1050cm^-1 ）的位移不明顯，但強度增加.1482cm^-1 處的甲基和亞甲基吸收峰對結構分析意義不大.這些現象主要歸因于分子間氫鍵 （X-H…Y） 的形成.根據化學鍵振動頻率與力常數的關系，氫鍵的形成導致化學鍵長增加、力常數減小，從而使紅外吸收峰發生紅移（向低波數移動）[16].同時，氫鍵的締合還會使譜帶變寬、吸收強度增強.

圖1（b）表示了甜菜堿-甘油及其兩種單一組分的紅外光譜圖.結果顯示，甜菜堿-甘油的羥基振動峰從 3579cm^-1 紅移至 3578cm^-1 ，峰形顯著變寬，但紅移幅度較小，表明氫鍵作用相對較弱.這說明甜菜堿-甘油體系的形成不僅依賴于氫鍵，還可能涉及其他作用力[17].Kumar等[18]的研究表明，在甜菜堿-尿素體系中，除了氫鍵外，庫侖力和范德華力也發揮了重要作用.

如圖1（c）所示，脯氨酸-甘油的羥基振動峰也出現變寬現象，但不顯著.這是由于脯氨酸-甘油中氫鍵的主要形式為 N-H…O. 在 1677cm^-1 處的酰胺吸收峰顯著紅移并變寬，進一步支持了氫鍵的存在.

類似地，在乳酸-甘油（如圖1（d）所示）以及甜菜堿-葡萄糖（如圖1（e）所示）、脯氨酸-葡萄糖（如圖1（f所示）幾種DESs的譜圖也表現出相同的氫鍵締合現象.綜上所述，所制備得到的DESs主要通過氫鍵相互作用形成.

（b）B-Gly及其單一組分FI-IR圖

2.3低共熔溶劑極性分析

低共熔溶劑（DeepEutecticSolvents，簡稱DESs）是一種具有獨特性質的溶劑體系，其極性是眾多關鍵物化性質中的重要一環.這種極性在很大程度上決定了低共熔溶劑的溶解能力，即它能夠溶解哪些物質以及溶解的程度如何.此外，極性還影響著低共熔溶劑的反應活性，進而決定了它在化學反應中能夠參與哪些反應以及反應的速率和程度.通過傅里葉紅外光譜分析表明，DESs之主要是通過分子間氫鍵形成，其極性受外部因素顯著影響：Pey等[19.20]發現水分會增強極性（氫鍵網絡破壞），而溫度對極性無明顯作用.目前外源物質影響機制較明確，但內源組分（尤其是非氯化膽堿體系）因復合配比研究仍不充分，本研究系統測定了20種DESs的極性（Pro-Glu體系因顯色干擾未納入），通過圖2與表2揭示了組分-極性關聯規律.

本研究利用尼羅紅作為溶劑致變色探針，通過測定其最大吸收波長 （λ_max ）紅移程度間接評估DESs的極性：極性越大， λ_max 紅移越顯著，對應ENR值越小（結果如表2所示）.實驗結果表明，乳酸基和檸檬酸基DESs因具有豐富的羥基和羧酸基團，其極性顯著高于其他DESs，這證實有機酸類DESs通過增強的氫鍵網絡和質子供給能力展現出更強極性特征，與Dai等[21]、Craveiro等[22]和Florindo等[23]關于氫鍵供體性質影響極性的研究結論相吻合.值得注意的是，同類型氫鍵受體（HBAs）制備的DESs呈現出相近極性值，進一步驗證了HBAs的化學結構是決定DESs極性特征的關鍵主導因素.

圖2尼羅紅測定DESs極性的紫外-可見光譜圖

表220種DESs的極性

2.4低共熔溶劑物理性質分析

2.4.1 pH

由于DESs的組成成分不一，形成溶液后酸堿度也有所差異.在使用DESs作為溶劑時，其酸堿度對反應起到了至關重要的影響，尤其是在酯化和酯交換反應中[23].因此，確定DESs的酸堿度對其在物質提取、生物催化等領域的應用有著重要研究意義[24，25].本研究對所制備的21種DESs進行了pH 測定，結果如表3所示.從表3中可以看出，在以弱酸性的ChCl和弱堿性的B作為HBAs的DESs中，除中性HBDs外，DESs酸堿性的隨HBDs的變化而變化，但是當HBDs為中性物質如醇類時，ChCI體系DESs呈弱酸偏中性，而B體系DESs呈弱堿偏中性.中性的Pro形成的DESs 酸堿性也主要由HBDs決定，但在酸性較強的Lac體系DESs中，HBDs的酸堿性對于整體的影響不大.由此結合布朗斯特酸堿理論可知，DESs的酸堿性主要由組分中給質子能力或接受質子能力強的一方決定.因此，對于二元組分的DESs，在確定了其中一個組分后，可以通過調控另外一個組分的種類來決定DESs的酸堿性.

2.4.2 密度

研究表明，DESs的密度通常大于水和大多數有機溶劑，在 298.15K 時約為 1.0～1.35g/cm^3[26] .本研究測定了21種DESs的密度（如表3所示），范圍在 1.138～1.344g/cm³ 之間.研究發現以甘油、檸檬酸和葡萄糖為HBDs的DESs密度較高.盡管甜菜堿和脯氨酸摩爾質量相近且條件相同，但形成的DESs密度差異較大.這種差異主要源于組分的分子結構和分子間相互作用：甘油和葡萄糖的多羥基結構以及檸檬酸的多羧基結構可形成致密的氫鍵網絡，從而增加密度.Florindo等[15]發現羧酸的引入會提高密度.從微觀角度看，DESs的密度與其自由體積和孔隙大小相關，可通過空穴理論解釋[27，28].當氫鍵網絡致密時，粘度增加，孔隙變小，密度升高粘度與密度的關系將在后續討論.

2.4.3 水分活度

DESs由氫鍵作用形成，而水分子本身也富含氫鍵，因此水分的引人會對DESs的性質產生本質影響.水分活度反映了溶劑中水分的存在形式，并對DESs產生本質影響.本研究測定了21種DESs的水分活度（如表3所示），結果顯示，除BCA體系外，其20種DESs均處于低水分活度狀態，表明其水分主要以結合水形式存在.這說明在DESs制備過程中，水分與DESs組分結合形成氫鍵，與FT-IR結果一致.

從密度角度看，氫鍵對DESs密度有顯著影響.例如，本研究中制備的ChCl-CA和B-CA體系在相同條件下，理論上ChCl-CA的密度應更高，但實際結果相反.此外，B-CA的水分活度較高，表明其水的結合程度較低.這說明適量水分的加入可以促進DESs中氫鍵的形成，而過多水分則會破壞氫鍵結構.這一現象與Makos等[29]的研究一致，即少量水分可形成穩定的配合物，但過量水分會破壞DESs 的結構.

表3DESs的pH、密度及水分活度

注：標“-\"為無法測定

2.4.4 粘度

粘度作為DESs的一項關鍵物理性質，在其眾多應用中扮演著至關重要的角色.具體來說，粘度顯著地影響著反應過程中的傳質效率DESs的粘度特性主要由其內部的幾種相互作用力決定.氫鍵、范德華力和靜電相互作用等作用力，這些作用力共同形成了相對穩定的結構，并與溫度、水分含量及組分構成密切相關.由于內部強作用力形成的結構穩定性，DESs普遍呈現高粘度特性，這對工業應用形成制約.研究顯示，與傳統離子液體相似，DESs 粘度具有顯著溫度敏感性[27.30].因此，通過調整組分以制備新型DESs或改變溫度，是降低其粘度的有效途徑.在實際應用中，降低粘度對于提高反應效率和降低成本具有重要意義.

升溫時，所有DESs粘度降低，高粘度體系降幅更明顯.因溫度升高使分子間作用力減弱，分子獲得能量自由移動，符合空穴理論：溫度升高增加分子間自由體積和溶劑孔隙大小，使溶劑分子更自由地移動，使得溶劑粘度下降，密度變小.為進一步研究不同DESs粘度隨溫度變化機理，利用擬合方程公式（4）計算[31]，結果如圖3及表4所示.

式（4）中： η 為某溫度下的DESs粘度； η₀ 為常 數； E_η 為DESs的粘流活化能 ?KJ/mol? ： R 為理想氣 體常數 （8.314J?mol^-1?k^-1） ; T 為測定溫度（K）.

圖3不同體系DESs在 、45C，55C 下的粘度

表4DESs粘度與溫度擬合結果

圖4為所制備的21種DESs的粘度與溫度變化后的 lnη 和 1/T 呈良好的線性關系，符合阿倫尼烏斯方程.擬合結果如表4表明，相關系數均高于0.945，且DESs的粘流活化能 （E_η ）與粘度成正比. E_η 越大，其受溫度的影響越顯著，根據空穴理論， E_η 是流動單元躍遷到空穴所需的最小能量.當溶劑粘度較大時，空穴體積較小，分子間作用力較強，流動單元躍遷所需的能量也更高.因此，DESs的粘度與溫度呈負相關，而與密度和分子間作用力呈正相關.

圖4不同體系DESs的粘度與溫度的擬合圖

2.4.5不同低共熔溶劑中LipaseG50水解活力分析

DESs的出現極大地推動了溶劑和生物酶催化領域的發展.現有研究表明，DESs能夠穩定脂肪酶的結構并作為保護劑，部分DESs甚至可以提升脂肪酶的活性[32，33].然而，目前關于DESs對脂肪酶的研究多集中于甘油三酯脂肪酶，而對偏甘油酯脂肪酶的作用研究較少.本研究以偏甘油酯脂肪酶LipaseG50為對象，探討不同DESs對其的影響，結果如圖5所示.

圖5不同DESs中LipaseG5O 的水解活力

在實驗中觀察到，LipaseG5O在九種強酸性DESs（如ChCl-Lac、ChCl-CA、B-Lac、B-CA、ProLac、Lac-Gly、Lac-EG、Lac-U、Lac-Glu）中完全失活，表明強酸性環境會破壞酶的活性.值得注意的是，在某些體系（如B-Lac、Lac-U）中，滴定后會出現短暫的紅色，隨后迅速消失，而pH計測量結果顯示溶液呈中性，這使得滴定終點難以判斷.這一現象的原因在于滴定液中的水分破壞了DESs中的氫鍵，導致酸性組分被釋放并迅速被NaOH中和，雖然有研究通過添加類似物來調節DESs的pH以適應酶催化條件，但這會引入額外組分，使體系復雜化，而使用緩沖液調節pH則會引入水分，破壞DESs的結構[33].因此，這類強酸性DESs不僅不適用于LipaseG5O的催化反應，還可能對其結構造成破壞.

2.4.6 不同低共熔溶劑中LipaseG5O熱穩定性分析

溫度能影響DESs的粘度，間接決定了生物酶在催化過程中的傳質速率[34，35]，同時，溫度對于酶的活性也有著至關重要的影響.本研究以上述實驗篩選的LipaseG5O在其中水解酶活較好的4種DESs為例，研究結果如圖6所示.

圖6LipaseG5O在不同體系和溫度下的水解酶活

由圖6可知，隨著溫度升高，五種體系下酶活性均下降，高溫破壞了酶的結構.但在 40°C 時，Li-paseG5O在ChCl-U中活性顯著提升，而在B-U中活性大幅下降.這可能是因為游離脂肪酶需要更多水分維持穩定，ChCl-U結合水分更緊密且ChCl吸水性強，而B-U中水分逐漸喪失，甜菜堿無法穩定酶的水化層，高溫使氫鍵斷裂、尿素釋放，導致酶構象改變.

此外，LipaseG5O在兩種脯氨酸基DESs（ProGly和Pro-U）中表現出良好的熱穩定性.在ProGly中，酶活性在 60^°C 時仍保持 80% ， 70C 時保留 50% ;在Pro-U中， 30°C 時活性是無溶劑體系的2.5倍，盡管隨著溫度升高活性下降，但在 70°C 時仍有一定活性保留.這可能與體系中尿素的性質和高溫有關.

2.4.7 低共熔溶劑性質與LipaseG50活力與穩定性的相關性

研究表明，DESs的理化性質直接影響LipaseG50 的活性和穩定性.LipaseG50在DESs中表現出良好的酸堿耐受性，尤其對堿性DESs的耐受性優于酸性體系.在高極性DESs（如ChCl-Lac、ChCl-CA、Lac-Glu）中，酶活性喪失可能與溶劑極性過大有關.此外，高粘度 （gt;10000mPa?） 的DESs會顯著抑制酶活性，而粘度在 范圍內的DESs則對酶活性影響較小.

尿素基HBDs和脯氨酸基HBAs構成的DESs對LipaseG5O的活性和熱穩定性有顯著促進作用，可能分別通過保護酶分子表面的水化層和穩定酶結構實現.因此，在設計適合LipaseG50催化的DESs時，應優先選擇氨基酸類、酰胺類和醇類組分，避免使用強酸性、強堿性、高極性或多羥基/多羧基組分，以防止體系粘度過高，從而優化酶的催化性能.

3結論

在本研究制備了21種不同類型的低共熔溶劑（DESs）.隨后，對這些DESs的理化性質進行了詳細的表征分析，并進一步研究了它們對偏甘油酯脂肪酶（LipaseG5O）活性和穩定性的影響.最終得出的研究結論如下：

（1）DESs的理化性質主要由組分間的氫鍵網絡決定.其酸堿度受組分質子供/受體能力的協同作用調控，極性主要由氫鍵受體（HBAs）主導.黏度與分子間作用力及密度呈正相關，且隨溫度升高顯著下降，符合阿倫尼烏斯方程.水分活度分析表明，DESs中水分多以結合態存在，過量水分可能會破壞氫鍵結構.值得注意的是，以醇類或酰胺類為HBDs的DESs具有低黏度特性，更適合作酶催化體系；而多羥基/羧基類DESs因其高黏度特性會影響酶促反應傳質效率.

（2）LipaseG50在DESs中表現出顯著的酸堿耐受性，當極性在一定范圍內變化時，對酶活性的直接影響不顯著；但在強極性或強酸性環境下，酶活性會顯著下降甚至失活.尿素基（ChCl-U、B-U）及脯氨酸基（Pro-Gly、Pro-U）DESs對酶活性和熱穩定性具有雙重促進作用.這一效應可能與尿素對酶表面水化層的保護作用及脯氨酸對活性位點的輔助結合有關.相比之下，強酸性（如Lac-Gly）或高黏度（如Pro-Lac）DESs因能破壞酶構象或限制傳質，導致酶活性顯著下降.

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【責任編輯：陳 佳】