一例斷奶仔豬輪狀病毒與大腸埃希菌混合感染的診斷及分析

仔豬腹瀉是規(guī)模化豬場(chǎng)的主要問(wèn)題之一，導(dǎo)致高死亡率及嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。其病因復(fù)雜，包括病毒（如豬輪狀病毒（PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV））、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)及管理不當(dāng)?shù)纫蛩亍Ｆ渲校《九c細(xì)菌混合感染較為常見(jiàn)。2025年4月，福建省福安市某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)75% 的斷奶仔豬陸續(xù)出現(xiàn)嘔吐、排黃白色水樣稀糞等癥狀，隨病程發(fā)展，病豬出現(xiàn)食欲減退、消瘦、四肢無(wú)力，最終脫水衰竭死亡，使用多種抗生素均無(wú)效。本研究采集病死豬的肺臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸道內(nèi)容物，通過(guò)熒光定量PCR、細(xì)菌分離培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)等進(jìn)行綜合診斷。現(xiàn)報(bào)告如下

1材料和方法

1.1病料來(lái)源

采集福建省福安市某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的4頭病死豬肺臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸道內(nèi)容物等樣品

1.2主要試劑

DNA/RNA核酸提取試劑盒購(gòu)自西安天隆科技有限公司，PoRV/TGEV/PEDV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州易安生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器

熒光定量PCR儀（Q1000，杭州郎基科學(xué)儀器有限公司）、全自動(dòng)核酸提取儀（NP968-C西安天隆科技有限公司）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD蘇凈安泰）。

1.4診斷方法

第一，臨床觀察與病理剖檢。詳細(xì)記錄豬場(chǎng)的發(fā)病情況和臨床癥狀。對(duì)病豬進(jìn)行剖檢，觀察并記錄各組織器官大體病理變化。

第二，病毒核酸檢測(cè)。稱取同一病死豬組織病料 1g ，加入1mL生理鹽水研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至滅菌離心管，與腸道內(nèi)容物拭子混勻， 12 000r/min 離心2min ，取上清液至新的滅菌離心管。使用全自動(dòng)核酸提取儀及配套試劑盒提取總RNA/DNA。按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。反應(yīng)程序： 95‰ 預(yù)變性5min ： ， 60°30s （收集FAM信號(hào)），共45個(gè)循環(huán)。設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。以CT值lt;40判定為陽(yáng)性。

第三，細(xì)菌的分離與鑒定。無(wú)菌操作取肺臟、肝臟及腸道組織等組織樣品，剪碎后加人無(wú)菌生理鹽水勻漿，靜置取上清液備用。將上清液涂布于含5% 脫纖維綿羊血的TSA瓊脂培養(yǎng)基， 37^°C 條件培養(yǎng)18～24h 。挑選生長(zhǎng)良好的可疑菌落，劃線接種法將其分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基， 37^°C 條件培養(yǎng) 18～20h ，觀察菌落，挑取優(yōu)勢(shì)菌落及可疑單菌落進(jìn)行革蘭染色和生化鑒定。

第四，藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。取 100μL 培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在平板上，靜置5min ，無(wú)菌鑷夾取紙片，按 ：25mm 間距貼附于平板表面。 37^°C 恒溫培養(yǎng)箱中孵育 16～18h 。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)量各藥物抑菌圈直徑，每片測(cè)量3次取均值，并記錄。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（NCCLS）的判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

第五，動(dòng)物致病性試驗(yàn)。將10只SPF小白鼠分試驗(yàn)組和對(duì)照組，各5只。試驗(yàn)組小鼠腹腔接種 10.2mL 菌液，菌液濃度為 1.0×10⁸CFU/mL ；對(duì)照組小鼠腹腔接種 0.2mL 滅菌生理鹽水。

2結(jié)果與分析

2.1剖檢病變

剖檢病變集中于消化道：表現(xiàn)為腸道（尤其空腸和回腸）嚴(yán)氣，部分空腸和回腸腸壁變薄，呈半透明，腸內(nèi)容物為黃白色水樣或漿液性液體。腸系膜淋巴結(jié)明顯充血、腫大。詳見(jiàn)圖1。

2.2病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)定量PCR對(duì)腹瀉樣本進(jìn)行PoRV、TGEV和PEDV的病原學(xué)檢測(cè)（見(jiàn)表1）。PoRV檢測(cè)：4份樣品均呈典型“S”形擴(kuò)增曲線（如圖2），4份樣品CT分別值為30.29，30.85，31.75，32.28，均小于35，陽(yáng)性對(duì)照CT值為18.86，陰性對(duì)照未檢測(cè)出CT值，陰陽(yáng)性結(jié)果成立，4份樣本的PoRV核酸呈陽(yáng)性。TGEV檢測(cè)：4份樣本的TGEV的核酸檢測(cè)均為陰性（如圖3），均未檢測(cè)出CT值，陽(yáng)性對(duì)照CT值為18.15，陰性對(duì)照未檢測(cè)出CT值。PEDV檢測(cè)：4份樣本的PEDV的核酸檢測(cè)均為陰性（如圖4），均未檢測(cè)出CT值，陽(yáng)性對(duì)照CT值為19.44，陰性對(duì)照未檢測(cè)出CT值。因此，病原學(xué)檢測(cè)證實(shí)該豬場(chǎng)的腹瀉疫情由豬輪狀病毒（PoRV）感染所致，排除TGEV與PEDV感染。

實(shí)踐案例

表1PoRV/TGEV/PEDV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果

樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，在血瓊脂平板上形成圓形、灰白色、邊緣整齊的不透明菌落，直徑為 2～3mm 在麥康凱瓊脂平板上形成中等大小、不透明的粉紅色菌落。挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短直桿菌（如圖5）。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定結(jié)果為：吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性、尿素酶試驗(yàn)陰性，符合大腸埃希菌的典型生化特征。

圖1病死豬剖檢結(jié)果

圖2豬輪狀病毒（PoRV）擴(kuò)增曲線

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離到的大腸埃希菌對(duì)硫酸黏菌素敏感，對(duì)頭孢噻肟和阿米卡星中介，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、硫酸新霉素、紅霉素和克林霉素等11種藥物耐藥。詳見(jiàn)表2。

表2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R為耐藥，I為中介，S為敏感

圖3豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）擴(kuò)增曲線

2.5致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠于接種15h后開(kāi)始死亡，20h內(nèi)全部死亡；對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，未見(jiàn)異常。剖檢可見(jiàn)試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)肺部和腸道出血性炎癥病變。取肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定與原始分離菌株一致。

3討論

本研究通過(guò)病原學(xué)檢測(cè)、分離鑒定及動(dòng)物試驗(yàn)，確診福建省福安市某豬場(chǎng)暴發(fā)的斷奶仔豬腹瀉死亡病例是由豬輪狀病毒（PoRV）與致病性大腸埃希菌混合感染引起。病毒檢測(cè)PoRV陽(yáng)性，結(jié)合水樣腹瀉、小腸腸壁變薄等病變，符合輪狀病毒感染特征。細(xì)菌學(xué)鑒定證實(shí)為致病性大腸埃希菌，小鼠致病性試驗(yàn)顯示試驗(yàn)組20h內(nèi)全部死亡，剖檢見(jiàn)嚴(yán)重肺部和腸道出血性炎癥，并重新獲得到原接種菌。

豬輪狀病毒是一種能夠引起1～8周齡仔豬急性傳染性腸道疾病的病原，尤其對(duì)斷奶仔豬的感染力和致病力較強(qiáng)。病毒主要破壞小腸絨毛頂端的成熟吸收上皮細(xì)胞，導(dǎo)致絨毛萎縮、隱窩增生，嚴(yán)重?fù)p害腸道的消化吸收功能。本研究中，斷奶仔豬母源抗體水平下降，加之的應(yīng)激因素（如環(huán)境變化、飼料轉(zhuǎn)換），是其易感PoRV的重要原因。PoRV感染造成的腸道黏膜屏障損傷，為腸道常在菌或環(huán)境中的致病性大腸埃希菌提供了人侵和增殖的有利條件。本病例分離的大腸埃希菌證實(shí)具有多重耐藥性（MDR），僅對(duì)硫酸黏菌素敏感，對(duì)臨床常用的氨基糖苷類（慶大、卡那、新霉、大觀）、氟喹諾酮類（恩諾、環(huán)丙）、四環(huán)素類（多西、四環(huán)）、氯霉素類（氟苯尼考）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉）、林可胺類（克林）等多種藥物耐藥。這種廣泛的耐藥性極可能是豬場(chǎng)長(zhǎng)期、不規(guī)范或預(yù)防性使用抗生素的結(jié)果，也是導(dǎo)致臨床使用多種抗生素治療無(wú)效的關(guān)鍵原因。多重耐藥菌株的出現(xiàn)不僅使治療更加困難，也存在通過(guò)食物鏈或環(huán)境傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)，構(gòu)成公共衛(wèi)生隱患[1-2]

此外致病性大腸埃希菌（特別是強(qiáng)致病株）產(chǎn)生毒素（如腸毒素、內(nèi)毒素）加劇了腸道炎癥、腹瀉和全身性病理?yè)p傷（如本試驗(yàn)小鼠表現(xiàn)的肺部病變）[3]王振玲[3的研究也指出，輪狀病毒與致病性大腸埃希菌（特別是O157：H7）混合感染時(shí)，其危害遠(yuǎn)大于單一病原感染。

基于診斷結(jié)果，現(xiàn)提出綜合防控建議：在免疫預(yù)防方面，對(duì)母豬實(shí)施PoRV疫苗的科學(xué)免疫（如弱毒苗或滅活苗），以提高初乳和常乳中PoRV特異性抗體（尤其是SIgA）水平，保護(hù)哺乳仔豬4，同時(shí)可考慮在仔豬斷奶前適時(shí)接種輪狀病毒疫苗。加強(qiáng)生物安全管理需做到嚴(yán)格消毒，尤其注重產(chǎn)房、保育舍的徹底清洗與有效消毒[]，且運(yùn)輸工具、人員物品也要嚴(yán)格消毒；產(chǎn)房、保育舍嚴(yán)格執(zhí)行全進(jìn)全出制，徹底清洗消毒并空欄干燥后再轉(zhuǎn)入新豬群；限制人員隨意串舍，進(jìn)出生產(chǎn)區(qū)嚴(yán)格淋浴、更衣、換鞋。改善飼養(yǎng)管理應(yīng)做好環(huán)境控制，保證產(chǎn)房、保育舍溫度（尤其斷奶初期，維持25 C 左右）、濕度適宜，減少溫差應(yīng)激，確保良好通風(fēng)以降低有害氣體濃度；保證新生仔豬及時(shí)、足量吃到初乳，對(duì)弱仔進(jìn)行人工輔助哺乳或寄養(yǎng)，提供易消化、營(yíng)養(yǎng)均衡的斷奶料，適當(dāng)添加酸化劑、益生菌（如乳桿菌、雙歧桿菌）；同時(shí)減少應(yīng)激，做到斷奶操作輕柔，避免粗暴混群，保證飲水清潔充足。科學(xué)用藥與治療上，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果（僅對(duì)黏菌素敏感），可在獸醫(yī)指導(dǎo)下，對(duì)嚴(yán)重細(xì)菌性感染的仔豬謹(jǐn)慎使用硫酸黏菌素進(jìn)行治療，頭孢噻肟（中介）需高劑量或聯(lián)合用藥，嚴(yán)格避免使用藥敏顯示耐藥的抗生素，且輪狀病毒感染無(wú)特效抗病毒藥；對(duì)腹瀉仔豬及時(shí)補(bǔ)充口服補(bǔ)液鹽（含葡萄糖、甘氨酸、電解質(zhì)），防止脫水和酸中毒[3]，口服L-谷氨酰胺可能有助于受損腸黏膜修復(fù)和電解質(zhì)吸收；在治療后期或預(yù)防階段，可使用益生菌制劑調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制致病菌定植。此外，要定期對(duì)豬群（尤其腹瀉病例）進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)，掌握流行毒株/菌株變化及耐藥性動(dòng)態(tài)，及時(shí)調(diào)整免疫程序和用藥方案。

結(jié)語(yǔ)

本研究確診福建省福安市某豬場(chǎng)斷奶仔豬暴發(fā)的腹瀉、死亡疫情是由豬輪狀病毒（PoRV）與致病性大腸埃希菌混合感染所致。防控該病的關(guān)鍵在于加強(qiáng)母豬和仔豬的免疫接種、嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施、改善飼養(yǎng)管理以減少應(yīng)激、并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)地使用有效抗生素（如硫酸黏菌素），同時(shí)輔以支持療法和微生態(tài)調(diào)節(jié)。

參考文獻(xiàn)：

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收稿日期：2025-09-08

作者簡(jiǎn)介：陳鋮（1983—），男，漢族，福建省福安市，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物生產(chǎn)與疫病防控。