牦牛病毒性腹瀉的早期診斷與防控技術(shù)

昌都市牦牛存欄量占西藏自治區(qū)牦牛存欄總量的 15% ，牦牛養(yǎng)殖收入占昌都農(nóng)牧民收入 60% ，是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。

1牦牛病毒性腹瀉臨床癥狀

急性感染表現(xiàn)為初期體溫升高至 40～41.5°C 持續(xù)3～5d，伴有劇烈水樣腹瀉，日排便量為正常的3倍，糞便中可見(jiàn)黏液和血絲，腹瀉持續(xù)1～2周，隨后口腔黏膜出現(xiàn)廣泛潰瘍，特別是頰部、齒齦病變較為明顯，鼻腔流出漿液性分泌物，部分病例出現(xiàn)跛行，蹄部冠狀帶糜爛等癥狀。持續(xù)感染PI牛體型較同齡牛小 30%～40% ，體重增長(zhǎng)速率降低 50% ，間歇性腹瀉，糞便呈黃綠色、酸臭，伴持續(xù)性脫毛和皮膚角化過(guò)度，胸腺萎縮，重量?jī)H為正常牛的 60% 淋巴細(xì)胞減少（ CD4+/CD8+ 比值下降至0.8，正常為1.5～2.0 ，妊娠母牛受到病毒感染后，在妊娠早期可致其流產(chǎn)，中期感染致胎兒畸形，小腦發(fā)育不全、腦積水，晚期感染產(chǎn)弱犢，出生體重低 20% ，PI犢牛出生時(shí)體重正常，但攜帶病毒且終身排毒，成為牧場(chǎng)內(nèi)主要傳染源。新生犢牛受到病毒感染后，往往在出生72h內(nèi)出現(xiàn)高熱，體溫升高至41 C 以上，嚴(yán)重脫水，死亡率為 50%～70% ，哺乳困難，因口腔潰瘍拒絕吮乳，體重日增重僅為 50～100g 。

2病理學(xué)變化

解剖病死牛可以發(fā)現(xiàn)其空腸和回腸黏膜充血、水腫，腸壁變薄，部分區(qū)域可見(jiàn)直徑 2～3mm 的潰瘍?cè)睿c道內(nèi)容物呈血水樣，腸系膜淋巴結(jié)腫大至正常的2～3倍，頰黏膜、舌面及食道黏膜多發(fā)性糜爛（“爛斑癥”），嚴(yán)重者融合成片狀壞死。全身淋巴結(jié)腫大，特別是腸系膜淋巴結(jié)重達(dá) 50～70g ，切面呈灰白色，髓質(zhì)出血，胸腺萎縮，重量 lt;100g ；脾臟白髓面積減少 40% 。組織學(xué)觀察可以發(fā)現(xiàn)，空腸絨毛高度由正常 800～1000μm 縮短至 300～500μm ，隱窩深度增加，腸上皮細(xì)胞廣泛空泡變性，局部脫落，固有層有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞密度降低 50% ，哈氏小體結(jié)構(gòu)破壞，白髓淋巴濾泡減少，動(dòng)脈周?chē)馨颓蕛?nèi)T細(xì)胞數(shù)量下降60% 。繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)，肺泡腔內(nèi)充滿纖維素性滲出物，肺泡壁增厚，妊娠母牛胎盤(pán)絨毛膜上皮細(xì)胞壞死，血管內(nèi)皮水腫，胎兒肝細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性包涵體。

3早期診斷

3.1ELISA血清抗體檢測(cè)

ELISA血清抗體檢測(cè)目的是檢測(cè)牦牛血清中BVDV特異性IgG抗體，篩查感染群體。提前準(zhǔn)備好BVDV抗體間接ELISA試劑盒，建議使用經(jīng)OIE認(rèn)證的商用試劑盒，如IDEXXBVDVTotalAbTest，采集牦牛血清，配置酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器、洗板機(jī)，稀釋濃縮洗滌液至1：25稀釋，每孔加入100μL 待測(cè)血清，稀釋比為1：40，即2 μL 血清 +78μL 稀釋液，設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔，在37 C 條件下孵育 30min ，避免震動(dòng)，自動(dòng)洗板機(jī)洗5次，每次300μL/ 孔洗滌液，手動(dòng)洗板需拍干殘留液體，每孔加入 100μ LHRP標(biāo)記的抗牛IgG抗體，在37℃條件下孵育 30min ，重復(fù)步驟4，洗板5次，每孔加入 100μLTMB 顯色液，室溫避光靜置 15min ，每孔加入 50μI 終止液，酶標(biāo)儀讀取 值（需 15min 內(nèi)完成），緊接著計(jì)算S/P值，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是： S/P≥0.4 ，提示抗體為陽(yáng)性，可能為既往感染或疫苗接種，可疑標(biāo)準(zhǔn)為 0.3≤S/ Plt;0.4 ，陰性是 S/Plt;0.3 。

3.2RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)的目標(biāo)是檢測(cè)BVDV核酸，兩種方法適用于急性感染、PI牛篩查及病毒分型。提前準(zhǔn)備好抗凝血、糞便或組織、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、熒光定量PCR試劑。設(shè)備主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、高速離心機(jī)、核酸電泳系統(tǒng)。RNA提取主要是 200μL 全血 +500μL 紅細(xì)胞裂解液， 2000rpm 離心5min，去血細(xì)胞、糞便或組織取 50mg 研磨后加1mLTRIzol裂解，TRIzol法提取RNA，操作時(shí)要求按氯仿一異丙醇分層（比例為 200μL . 50μL ）， 12 000R/min 離心15min （4^°C ），RNA溶于 20～50μL 無(wú)RNA酶水，在 -80°C 條件下保存?zhèn)溆谩Ｄ孓D(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（ 20μL ）：RNA模板（ 5μL ） + 隨機(jī)引物（ 1μL ， 50μM ） +dNIP （ 2μL ， 10mM ） +M-MLV （ 1μL ）+Buffer（ 5μL ）+RNase-free水（ 6μL ），反應(yīng)條件：在 25^°C 條件下反應(yīng) 10min 在42 °C 條件下反應(yīng) 50min 鐘 $$ 在 85^°C 條件下反應(yīng) 5min 在4 °C 條件下保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（ 25μL ）：cDNA（ 2μL ）+上下游引物（各 0.5μL 10μM ）+SYBRGreenMix（ 12.5μL ） +ddH₂O （9.5μL ），預(yù)變性在 94^°C 條件下 3min ，擴(kuò)增在94 °C 條件下 30s? 在55 C 條件下 30s? 在72 C 條件下45s（35循環(huán)），終延伸至在72 C 條件下 10min ，設(shè)置熔解曲線分析（ 60～95^°C ，每 0.5°C 讀值），區(qū)分特異性擴(kuò)增。

3.3膠體金檢測(cè)

取1g新鮮糞便，加 4～9mL 稀釋液振蕩混勻，靜置取上清待檢，試紙條及樣本需提前從冷藏取出，室溫平衡 15～30min ，吸取混勻樣本上清，垂直滴加80～100μL 于試紙條加樣孔S孔，水平放置試紙條于潔凈臺(tái)面。反應(yīng)時(shí)間為 10～15min ，設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照C線 + T線顯色，陰性對(duì)照僅C線顯色（T線無(wú)），陽(yáng)性判定依據(jù)為C線 ⁺¹ T線均顯紅色/紫色條帶（含弱陽(yáng)性：T線淺但肉眼可辨），陰性判定依據(jù)為僅C線顯色，T線無(wú)條帶，C線未顯色（無(wú)論T線是否顯色）判定無(wú)效，需重測(cè)。

4治療方案

患病牛口服蒙脫石散，成年牛劑量為 20g/ 次，犢牛為 5～10g/ 次，溫水調(diào)成懸浮液，口服，2次/d，吸附毒素，保護(hù)腸黏膜，同時(shí)使用復(fù)方氯化鈉注射液50～80mL/kg^?bw ，靜脈滴注，速度為 10mL/kg/h ，糾正脫水，一次用量，連續(xù)使用2～3d；中藥治療選擇葛根芩連湯加減，中藥方劑為葛根 60g 、黃芩 、黃連20g 、甘草 15g 、白頭翁30g加水 800mL ，煎煮剩余藥液至 300mL ，濾液灌服，成年牛每日1劑（早晚分服），連用5d，特牛藥液使用減半。持續(xù)感染期口服硫酸粘菌素，劑量為 6.6mg/kg^?bw ，1次/d，連用5d，同時(shí)搭配使用四君子湯合參苓白術(shù)散，中藥方劑為黨參 _40g 、白術(shù) 30g 、茯苓 30g 、甘草 15g 、山藥 、薏苡仁 40g 加水 800mL ，煎煮剩余藥液至 300mL ，灌服，成年牛每日1劑，連用15d，犢牛藥液使用減半，補(bǔ)氣健脾。恢復(fù)期推薦使用復(fù)合維生素B注射液 20mL /頭，肌注，一次用量，搭配使用補(bǔ)中益氣湯，中藥方劑為黃芪60g 、黨參 40g 、當(dāng)歸 、陳皮 20g 、升麻 15g ，將其研磨成粉末過(guò)篩處理后按照每頭成年牛每日1劑，添加到飼料中連用10d，特牛上述中藥方劑的藥物使用減半。

5預(yù)防措施

5.1疫苗接種管理

推薦使用牛病毒性腹瀉粘膜病滅活疫苗，犢牛首免為3月齡（母源抗體消失后），頸部皮下注射2mL，間隔21d注射同劑量以加強(qiáng)免疫。成年牛每年春、秋兩季各接種1次， 2mL 頭；妊娠母配種前4周接種，避免妊娠早期使用活疫苗，防胎兒感染，二免后30d抽取 5% 群體血清，ELISA抗體S/P值 ≥1.0 為合格，合格率 lt;80% 需全群補(bǔ)免，間隔 14d_c

5.2加強(qiáng)生物安全防范

生產(chǎn)環(huán)節(jié)要規(guī)范引種檢疫，新購(gòu)牛在獨(dú)立區(qū)域隔離 30d ，距離主牛群 ≥200m. 。隔離第1天、第15天采集EDTA抗凝血，RT-PCR檢測(cè)BVDV核酸和ELISA抗體檢測(cè)。兩次PCR檢測(cè)為陰性（Ct值 ≥40 ）且抗體S/P值 lt;0.3 ，判定為合格。消毒操作過(guò)程中，圈舍地面可使用 2% NaOH溶液噴灑， 300mL/m² ，每周1次，作用時(shí)間 ，器械設(shè)備推薦使用 0.5% 過(guò)氧乙酸浸泡 30min ，溫度為 15～25‰ ，或進(jìn)行紫外線照射，強(qiáng)度 ，作用 30min ，人員通道如腳踏池添加 12% 檸檬酸溶液，深度為 5cm ，每日更換。糞便進(jìn)行發(fā)酵，堆肥發(fā)酵溫度 ，持續(xù)7d以殺滅病毒，病死牛處理采取深埋（深度 ≥2m ）并覆蓋生石灰（ 3kg/m² ），或在爐溫 ≥800% 條件下焚燒處理。

5.3監(jiān)測(cè)與淘汰PI牛

重點(diǎn)要做好PI牛篩查，受到該種疾病威脅的養(yǎng)殖場(chǎng)或發(fā)生過(guò)該種疾病的養(yǎng)殖場(chǎng)，應(yīng)在犢牛出生后24h進(jìn)行耳緣組織采樣，RT-PCR檢測(cè)，Ct值 ≤35 判為PI牛，每年秋季采集 10% 牛的抗凝血，進(jìn)行PCR檢測(cè)病毒（PI牛終身排毒）或者抗體篩查，檢測(cè)出PI牛應(yīng)立即撲殺并進(jìn)行無(wú)害化處理。所在圈舍全面消毒。急性感染牛隔離至獨(dú)立病區(qū)，連續(xù)3dPCR轉(zhuǎn)陰后歸群。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，牦牛病毒性腹瀉防控期間通過(guò)構(gòu)建以“早期診斷一精準(zhǔn)干預(yù)一綜合預(yù)防”為核心的防控技術(shù)體系，明確分階段中西醫(yī)協(xié)同治療的差異化方案，并形成覆蓋疫苗接種、生物安全、環(huán)境調(diào)控等全鏈條管理規(guī)范，推動(dòng)牦牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展

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收稿日期：2025-09-04

作者簡(jiǎn)介：張發(fā)忠（1993—），男，漢族，青海省湟源縣，本科，獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)和防控。