匍匐翦股穎GIGANTEA基因克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2025）09-2777-09

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.09.003

Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of GIGANTEA gene in Agrostis stolonifera L.

XIA Qing-qing，AI Ye， ZENG Li-ping*，CHAO Yue-hui （School ofGrassland Science，Beijing Forestry University，BeijinglOoo83，China）

Abstract： GIGANTEA（GI） is a plant-specific nuclear protein with important role in drought stress and salt stress. In order to investigate the stress responses of GI gene in Agrostis stolonifera（AsGI，we carried out gene cloning，subcellular localization and its expression analysis.The results showed that the complete coding region of AsGI is 3468 bp in length and it encoded 1156 amino acids. The phylogenetic tree showed that the protein encoded by the GI gene was relatively close to the evolutionary relationship with homologous proteins of Avena satiua，Lolium perenne and other graminoids. The subcellular localization results showed that the protein located in the nucleus，and the AsGI gene was expressed in both aboveground and belowground parts. The expression of the GI gene varied at different developmental stages，as the highest level in young plants and the lowest level in senescent plants.Analysis of the expression pattrn with the treatment ofdiferent hormones and stresses showed that four hormones，IAA，6-BA， GA₃ and ABA could promote the GI gene expression. Salt stress and drought stressalso induced the expression of the GI gene.This study lays the foundation for further research on the function of GI gene.

Key Words： GIGANTEA;Agrostis stolonifera; Expression analysis; Protein localization nucleus;Salt stress; Drought stress

GIGANTEA（GI是一種植物特有的核蛋白，在植物的多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用[1-2]。Park等[3-4]發(fā)現(xiàn)， GI 基因?qū)χ参镯憫?yīng)逆境脅迫有一定的作用，如低溫、氧化、干旱及鹽脅迫等。早期研究中，Kurepa等[5]發(fā)現(xiàn)擬南芥中的 GI 突變體會(huì)延長(zhǎng)開花時(shí)間，并且鹽脅迫也會(huì)對(duì)野生型植株的開花時(shí)間產(chǎn)生延遲。值得注意的是， GI 基因的存在能夠增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的耐受性。另一方面，Akram的研究揭示了棉花（Gossypiumhirsutum）中的 GI 基因具有顯著的耐鹽特性，它通過(guò)調(diào)節(jié)如SOS蛋白和NHXs這類與植物鹽堿抵抗相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而影響棉花對(duì)鹽堿環(huán)境的適應(yīng)能力。Cao等發(fā)現(xiàn)GI基因通過(guò)非依賴CBF途徑提高擬南芥植株耐寒性，研究還發(fā)現(xiàn)，相較于野生型擬南芥，低溫脅迫對(duì)gi-3突變體的開花時(shí)間影響更為顯著。Kim等[8發(fā)現(xiàn) GI 通過(guò)SOS途徑介導(dǎo)了植物響應(yīng)鹽脅迫。Dong等9發(fā)現(xiàn)GI基因調(diào)控大豆的開花時(shí)間和改變鹽脅迫耐受性。GI基因不僅在鹽脅迫下表現(xiàn)出強(qiáng)大的功能，還在其他逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bader等[10]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)ABA和 GI 相互作用響應(yīng)干旱環(huán)境，揭示了植物對(duì)干旱的新應(yīng)對(duì)策略。在這種情況下， GI 可能通過(guò)調(diào)節(jié)植物的水分利用效率和氣孔運(yùn)動(dòng)來(lái)幫助植物保持水分平衡，進(jìn)一步減輕干旱脅迫對(duì)植物的影響。綜上， GI 基因的功能與作用具有多樣性和復(fù)雜性。

近十幾年，我國(guó)草坪業(yè)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，草坪草遺傳育種技術(shù)更是愈發(fā)受到人們廣泛關(guān)注，采用生物技術(shù)對(duì)草坪草種進(jìn)行改良具有廣闊前景和重要的應(yīng)用價(jià)值。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到許多非生物因子的脅迫。高低溫、旱澇和高鹽堿等不良環(huán)境的非生物因子會(huì)對(duì)植物造成傷害，這些非生物脅迫因子通過(guò)影響植物的生理生化過(guò)程進(jìn)而影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，從而降低了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。調(diào)查顯示，水分和土壤鹽堿化是草坪草生長(zhǎng)的主要限制因素，我國(guó)目前也面臨著抗旱耐鹽型草坪草種稀缺的問(wèn)題。通過(guò)植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用，克隆并轉(zhuǎn)化抗旱耐鹽基因，使其在草坪草中的高表達(dá)能顯著提高抗旱耐鹽草坪草新品種的選育[11]。匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）為禾本科翦股穎屬植物，是一種多年生冷季型草坪草[12]，它具有生長(zhǎng)速度快、綠期長(zhǎng)、耐寒、耐踐踏、耐低修剪、坪用性高、美觀等特點(diǎn)；其也有一些缺點(diǎn)，如根系較淺、不耐旱、不耐熱、不耐鹽。夏季的高溫天氣使匍匐翦股穎生長(zhǎng)緩慢，葉片枯黃萎蔫在北京一些地區(qū)常出現(xiàn)“夏枯”現(xiàn)象，影響草坪的使用功能，增加草坪的維護(hù)成本費(fèi)用[13]。本研究通過(guò)改良匍匐翦股穎的抗旱與耐鹽堿能力，不僅能優(yōu)化其生長(zhǎng)性能，還對(duì)鹽堿地的生態(tài)恢復(fù)具有關(guān)鍵意義。

GI作為廣泛存在植物體內(nèi)控制GI核蛋白合成的基因，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用，因此，有關(guān)禾本科草坪草—匍匐翦股穎的GI基因方面研究亟待補(bǔ)充。本試驗(yàn)選取匍匐翦股穎作為研究對(duì)象，成功地從該植物中克隆出GI基因。同時(shí)，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，亞細(xì)胞定位和表達(dá)水平分析，不僅為后續(xù)深入研究匍匐翦股穎 GI 基因的功能提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料，也有助于研究其他禾本科植物的特性，為相關(guān)領(lǐng)域的理論研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的植物材料為匍匐翦股穎‘PennA4'品種，來(lái)自實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；DNAMarker，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，pMD19-T克隆載體，均購(gòu)自Takara公司；PCRMix購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；植物激素ABA、6-BA、GA3和IAA購(gòu)于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知的基因序列利用PrimerPremier5.O軟件設(shè)計(jì)下列引物（表1）。設(shè)計(jì)引物GI-F和GI-R克隆目的基因全長(zhǎng)，引物3302Y-GI-F與3302Y-GI-R用于構(gòu)建亞細(xì)胞定位植物表達(dá)載體；通用引物3302Y-F和3302Y-R用于亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建檢測(cè)；引物RT-GI-F和RT-GI-R用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；引物AsACT-F和AsACT-R用于內(nèi)參基因Actin熒光定量檢測(cè)（表1）。

表1引物名稱與序列

Table1 Sequence of primer

1.2.2基因克隆采用Trizol法對(duì)匍匐翦股穎葉片的總RNA進(jìn)行提取，接著將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板展開PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)程序設(shè)定為： 95^°C 持續(xù)5分鐘； 94^°C 保持30秒， 55^°C 維持30秒，68^°C 歷經(jīng)2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)； 72^°C 延續(xù)5分鐘；12^°C 進(jìn)行保溫。把所得的PCR產(chǎn)物純化處理后，與載體pMD19-T進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為 16^°C ，時(shí)長(zhǎng)30分鐘。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，再把菌液涂布于含有 50mg?L^-1 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在 37^°C 的條件下進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。選取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將檢測(cè)出正確條帶的大腸桿菌送至北京睿博興科生物公司測(cè)序。通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，選取序列正確的菌液，提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)操作。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用DNAMAN分析該基因編碼的氨基酸序列；通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast功能進(jìn)行同源比對(duì)并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，通過(guò)MEGA5.0軟件，對(duì)該蛋白與不同物種同源蛋白之間構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）網(wǎng)站分析理化性質(zhì)；利用ProtScale （http：//ca. expasy. org/tools/protscale.htlm）網(wǎng)站對(duì)GI蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站判斷其跨膜區(qū)域;通過(guò)SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)其信號(hào)肽；利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 2.4 GI基因的表達(dá)分析為了分析 GI 基因的組織特異性表達(dá)狀況，選取生長(zhǎng)狀況良好的匍匐翦股穎植株，分別選取其地上部分、地下部分，幼嫩、成熟和衰老的葉片，液氮速凍后存于一 80^°C 冰箱中備用。 0.1mol?L^-1NaCl 溶液處理匍匐翦股穎樣品，用于分析 GI 基因鹽脅迫響應(yīng)； 20% 聚乙二醇溶液處理匍匐翦股穎樣品，用于分析 GI 基因干旱脅迫響應(yīng)。選取成熟的匍匐翦股穎植株，將 10mol?L^-1 的 IAA，10mol?L^-1 的 6-BA， 50mol?L^-1 的ABA、 50mol?L^-1 的 GA₃ 溶液分別噴施于匍匐翦股穎植株表面，并在 ^{0，0.5，1，2，4，6，8，12} 和 24h，9 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣[12]。對(duì)收集到的樣品進(jìn)行液氮速凍處理，隨后存放在一 80^°C 冰箱中留作備用。分別提取所有樣品的RNA，并借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以RT-GI-F和RT-GI-R作為引物，開展下一步的熒光定量PCR檢測(cè)。PCR程序設(shè)定為： 95^°C 持續(xù)10分鐘； 95^°C 保持40秒， 60^°C 維持60秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，采用 2^-ΔΔCt 法來(lái)計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[14]，運(yùn)用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS26.0軟件實(shí)施單因素方差分析。

1.2.5亞細(xì)胞定位以含有GI基因的克隆質(zhì)粒為模板，采用3302Y-GI-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在50^°C 條件下，使用無(wú)縫連接酶將純化的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒片段連接，并導(dǎo)人大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有 50mg?L^-1 卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，于 37^°C 恒溫培養(yǎng)8小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用 CaCl₂ 凍融法，將構(gòu)建好的3302Y-GI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中，經(jīng)過(guò)冰浴、液氮速凍、水浴及再次冰浴的處理后，加入LB溶液，在 28^°C 下振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。離心去除部分上清，將剩余菌液涂布在同時(shí)含有 50mg?L^-1 利福平和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，于 28^°C 暗培養(yǎng)兩天，挑取單菌落，使用3302Y-F/R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選出符合預(yù)期大小條帶的產(chǎn)物，并送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確后，將相應(yīng)的農(nóng)桿菌菌液保存于 -80^°C 冰箱中，以備后續(xù)使用。

將含有3302Y-GI載體的農(nóng)桿菌菌液加入含有利福平和卡那霉素（均為 50mg?L^-1） 的LB溶液中，于暗環(huán)境中培養(yǎng)至菌液 OD₆₀₀ 值達(dá)到0.6。選用生長(zhǎng)約1個(gè)月的健康煙草植株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)注射器將菌液注入煙草葉片的下表皮細(xì)胞。隨后，將煙草置于人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)48小時(shí)。制作煙草葉片的玻片樣本，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)，以確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 GI基因克隆

以GI-F和GI-R為引物對(duì)葡匐翦股穎cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶清晰，長(zhǎng)度在300Obp左右（圖1），連接T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將擴(kuò)增出目的條帶的菌液送生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的堿基序列與匍匐翦股穎 GI 基因序列一致，表明 GI 基因克隆成功，且獲得克隆載體pMD-GI。

2.2GI基因生物信息學(xué)分析

克隆獲得的 AsGI 基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為 3468bp 編碼1156個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為126.25KD，理論等電點(diǎn)為6.94。其正電荷殘基有111個(gè)，負(fù)電荷殘基為114個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為48.87，該蛋白的脂溶系數(shù)為91.29，總平均親水性值為-0.132 ，表明GI蛋白是一個(gè)親水性不穩(wěn)定蛋白（圖2A）。TMHMM2.0網(wǎng)站預(yù)測(cè)GI不存在跨膜序列（圖2B），推測(cè)其不是分泌性蛋白。利用Signal5.0網(wǎng)站進(jìn)行GI蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，GI蛋白不存在信號(hào)肽（圖2C）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，目的蛋白含有四種二級(jí)結(jié)構(gòu)， a 螺旋占 48.4% ， β- 轉(zhuǎn)角 4.24% ，延伸鏈8.05% ，無(wú)規(guī)則卷曲 39.31% 。通過(guò)SWISS-MODEL對(duì)GI蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，GI蛋白主要是由螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖2D）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，GI蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖2GI基因結(jié)構(gòu)分析

Fig.2Structural analysis of GI gene

圖1匍匐翦股穎 _GI 基因的克隆

Fig.1Cloning of GI gene from Agrostis stoloniferaL. 注：M，MB5000DNAMarker；1～4，目的基因GI Note：M，MB5000DNAMarker;1～4，Target geneGI

通過(guò)NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/last.gi）分析GI蛋白的氨基酸序列，與數(shù)據(jù)庫(kù)中GIGANTEA同源序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明20個(gè)蛋白分成兩個(gè)亞家族，且來(lái)自同一科的GI具有較近的進(jìn)化關(guān)系，如圖3所示，匍匐翦股穎GI蛋白與燕麥（AvenasatiuaL。）的同源蛋白親緣關(guān)系最近，其次是草甸羊茅（FestucapratensisHuds.）和多年生黑麥草（LoliumperenneL.），這些都屬于禾本科植物，符合植物進(jìn)化的關(guān)系。同源性比對(duì)表明，匍匐翦股穎與燕麥、草甸羊茅和多年生黑麥草等物種的GI蛋白序列均具有較高的保守性（圖4）。

2.3 熒光定量表達(dá)分析

2.3.1GI基因不同部位及發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析收集匍匐翦股穎地上和地下部分樣本，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GI基因在地上和地下部分中均有表達(dá)（圖5）。

收集不同發(fā)育時(shí)期的匍匐翦股穎葉片，對(duì)GI基因進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)表明， GI 基因在不同葉片發(fā)育時(shí)期存在顯著差異，幼嫩的葉片中表達(dá)量最高，成熟葉片次之，衰老葉片最低，幼嫩時(shí)期 GI 基因的表達(dá)量約是衰老時(shí)期的1.84倍（圖6）。

圖5 _GI 基因不同組織表達(dá)分析

圖6GI基因葉片不同發(fā)育階段表達(dá)分析

Fig.6Expression analysis of GI gene in different develop mental stages 注：小寫字母表示差異顯著 ?lt;0.05 ） Note：Lowercase letters indicate significant differences （ .^-0.05 ）

2.3.2GI基因?qū)τ诿{迫處理及外施激素的響應(yīng)對(duì)植物噴施不同的激素，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果表明， AsGI 基因分別受到4種激素的誘導(dǎo)（圖7）。噴施ABA激素后， GI 基因表達(dá)水平在4h達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，但經(jīng)過(guò)24h 處理后， GI 表達(dá)水平仍呈現(xiàn)較高水平的增加，24h 基因表達(dá)水平約為0h的3.83倍。噴施IAA激素后， GI 基因表達(dá)水平先緩慢上升，在8h達(dá)到峰值，隨后 GI 基因表達(dá)量逐漸降低，但總體高于 ^0h 組。這些數(shù)據(jù)表明，IAA可以促進(jìn) GI 基因的表達(dá)。噴施6-BA激素后， GI 基因表達(dá)水平在6h前穩(wěn)定上升， 6h 后緩慢下降，在 24h 達(dá)到峰值，約是0h的11.12倍。噴施 GA₃ 激素后， GI 基因表達(dá)水平呈現(xiàn)略有上升的趨勢(shì)，但整體表達(dá)水平變化不大，在 6h 的時(shí)候達(dá)到峰值，僅為 ^0h 的2.34倍，而在 24h 表達(dá)水平下降，僅為 ^0h 的1.60倍。

對(duì)于干旱和鹽脅迫處理，RT-qPCR結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)PEG處理后， GI 表達(dá)水平整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在8h到達(dá)頂峰， 24h 表達(dá)水平最低，僅為 ^0h 組的 24% ，說(shuō)明 AsGI 基因能夠參與鹽脅迫響應(yīng)；對(duì)于NaCl處理樣品，進(jìn)行RT-qPCR結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)NaCl處理后， GI 表達(dá)水平呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢(shì)，在 24h 的時(shí)候達(dá)到最低值，僅為0h的 27% ，說(shuō)明AsGI基因參與響應(yīng)NaC1脅迫（圖7）。

圖7不同處理下 _GI 基因的表達(dá)模式

Fig.7TheRT-qPCRof GI gene expression under different treatments

2.4 亞細(xì)胞定位

將已構(gòu)建的3302Y-GI載體轉(zhuǎn)入煙草中，并在暗處培養(yǎng)48小時(shí)。采用激光聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的煙草，記錄并分析激光信號(hào)。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示：使用3302Y-GI轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞，能夠在細(xì)胞核中觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而作為對(duì)照的3302Y，能夠在整個(gè)細(xì)胞中觀察到熒光信號(hào)（圖8），表明葡匐翦股穎GI蛋白定位于細(xì)胞核中。

圖8GI蛋白亞細(xì)胞定位

Fig.8Subcellular localization ofGI protein

3討論

目前植物 GI 基因在擬南芥中研究最多， GI 基因在響應(yīng)逆境脅迫方面具有重要作用。近年來(lái)，從火龍果（Hylocereusundulatus）{15]，大豆（Glycinemax）[16]，小麥（Triticumaestiuum）[17]等植物中相繼克隆出同源基因，但在匍匐翦股穎植株中的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)克隆了GI基因，其編碼區(qū)全長(zhǎng)3468bp ，編碼一條含有1156個(gè)氨基酸的多肽鏈。其理化性質(zhì)分析表明，GI為親水性不穩(wěn)定的蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)，也沒有信號(hào)肽，證明GI蛋白不是分泌蛋白。通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎與禾本科植物燕麥關(guān)系最近，其次是黑麥草，草甸羊茅。通過(guò)亞細(xì)胞定位顯示，GI基因定位在細(xì)胞核中，這與大豆[16]，甘藍(lán)型油菜（Brassicanapus）[18]，菊花（Den-dranthema morifolium）[19]，甘 薯（Ipomoea bata-tas）[20]，番荔枝（Annona squamosa ）[21]，核桃（Juglansregia）[22]，擬南芥[23]等相關(guān)研究的結(jié)果相同，說(shuō)明 GI 亞細(xì)胞定位在不同物種之間具有保守性，匍匐翦股穎 GI 基因進(jìn)化關(guān)系趨于穩(wěn)定，推測(cè)其具有匍匐翦股穎GI基因相似的功能。

通過(guò)RT-qPCR技術(shù)，可以定量分析 GI 基因在匍匐翦股穎不同部位和發(fā)育階段的表達(dá)水平。葉片不同發(fā)育階段的表達(dá)分析揭示了 GI 基因在不同生長(zhǎng)階段的動(dòng)態(tài)變化，這些信息對(duì)理解其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能具有重要意義。結(jié)果顯示， GI 基因在地上部分和地下部分中均有表達(dá)，說(shuō)明其廣泛存在于 GI 基因各個(gè)部位中，但不同的組織中表達(dá)量具有差異性[23]。已有研究表明，在小麥[17]、甘藍(lán)型油菜[18]、菊花[19]、甘薯[20]和棉花（Gossypium hirsutum）[24]中 GI 基因均有表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。GI 基因在幼嫩前期的高表達(dá)可能與其促進(jìn)植物生長(zhǎng)反月有大。住祖物生長(zhǎng)及月過(guò)性中祖物倣系扮演著十分重要的角色，不同激素對(duì)基因的響應(yīng)也存在差異。通過(guò)對(duì)匍匐翦股穎植株噴施IAA，6-BA，GA₃ ，ABA，4種植物激素，探究 GI 基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育可能存在的影響。Bader等人[10]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)ABA和 GI 相互作用響應(yīng)干旱環(huán)境。通過(guò)AsGI表達(dá)分析結(jié)果可知，該基因受ABA激素處理后表達(dá)量上升，說(shuō)明該基因表達(dá)在受到ABA誘導(dǎo)后上調(diào)， GI 可能會(huì)對(duì)逆境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。除了ABA激素， GI 基因與其他激素也存在相互作用[25]。結(jié)果表明IAA，6-BA， GA₃ 均能促進(jìn)GI基因表達(dá)。在復(fù)雜生境下生存的植物，人們對(duì)植物如何抵御干旱，鹽堿，寒冷，氧化等非生物脅迫的分子機(jī)制開展了大量研究[26-27]，同時(shí)也獲得了大量耐逆境的基因和轉(zhuǎn)基因植株。 GI 基因在脅迫條件下的表達(dá)變化反映了其在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中的重要功能。通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè) GI 基因在脅迫條件下的表達(dá)變化，結(jié)果顯示， GI 基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)顯著變化，表明它在脅迫條件下發(fā)揮重要作用。GI 基因能響應(yīng)ABA激活 SOCl 和 FT/TSF 基因使植物提前開花， GI 基因是光周期信號(hào)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵因子[28]。Checker等[29]發(fā)現(xiàn) GI 基因在干旱下以GI-mRNAl72E途徑抑制WRKY44轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控植物的耐旱特性，說(shuō)明 GI 基因使植物能提高植物的非生物脅迫，參與植物的逆境反應(yīng)途徑。本試驗(yàn)結(jié)果與棉花[24]、柑橘（Citrusreticu-lata）[30-31]、大豆[16]、月季（Rosachinensis）[32]等研究結(jié)果相一致。 GI 基因的上調(diào)可能與提高抗氧化酶活性，減少活性氧積累有關(guān)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性；而下調(diào)可能與減少能量消耗，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有關(guān)[3-35]。已有研究表明，表達(dá)擬南芥的GI基因[36]，可以提高草坪草的抗旱耐鹽性。類似的，本研究通過(guò)調(diào)控匍匐翦股穎的GI基因表達(dá)，可以開發(fā)出更耐鹽更抗旱的草坪草品種，適用于鹽堿地的綠化。GI基因在環(huán)境脅迫響應(yīng)中的作用使其成為抗逆性草坪草育種的潛在目標(biāo)。通過(guò)分子育種或基因編輯技術(shù)，可以提高草坪草的抗旱，耐鹽等抗逆性，這對(duì)于在惡劣環(huán)境條件下維持草坪草的健康生長(zhǎng)具有重要意義。

4結(jié)論

本研究成功克隆了匍匐翦股穎 GI 基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明， GI 編碼區(qū)全長(zhǎng)為 3468bp ，編碼1156個(gè)氨基酸，無(wú)信號(hào)肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位顯示該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。表達(dá)分析表明，匍匐翦股穎 GI 基因在地上和地下部分均有表達(dá)，說(shuō)明其在地上和地下部分均發(fā)揮作用。其表達(dá)受IAA，6-BA， GA₃ ，ABA調(diào)節(jié)。AsGI基因同時(shí)參與NaC1脅迫和鹽脅迫響應(yīng)。本研究不僅為匍匐翦股穎 GI 基因參與逆境脅迫的后續(xù)探索開啟了新視角，也從分子層面上為其他禾本科植物的基因功能筑牢了理論根基。

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（責(zé)任編輯彭露茜）