耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生物膜形成及多黏菌素B聯合替加環素的體外抗菌活性

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae biofilm formation and in vitro antimicrobial activity of polymyxin B in combination with tigecycline

Liu Jiel and Zhao Jianping2 （1 InnerMongoliaClinical MedicalCollege，InnerMongoliaMedical University，Hohhot010050; 2 Department ofLaboratory Medicine， Inner Mongolia People's Hospital，Hohhot 010010）

Abstract Objective To analyze the relationship between the biofilm formation capacity of Klebsiella pneumoniae （KPN）and carbapenem antibiotic susceptibility，and evaluated the antimicrobial efect of polymyxin B（PMB）and tigecycline （TGC） in vitro against clinically isolated carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP）.MethodsThe abilityof 66 KPN strains to form biofilm and thecorrelation between KPNbiofilm formation ability and carbapenem susceptibility were analyzed bycrystal violet staining method;the minimum inhibitory concentration of PMB and TGC against 31 clinical isolates was determined by broth dilution and checkerboard dilution，and some inhibitory concentration index was calculated.ResultsThe biofilm formationrate in the 66 KPN strains was 90.91% .The main specimen types of the biofilm-positive strains were sputum （ 60% andbronchial lavage fluid （18.33%） . The ICU （36.67%） was the major distributed department. The production rate of 31 CRKP strains was 90.63% .The35carbapenem-susceptible K. pneumoniae （CSKP） biofilm formation rate was 88.57% .There was no difference in biofilm formation ability between the CRKP and CSKP groups （Pgt;0.05） .The CRKP isolateswere obtained mainly from malepatients.TheICU （64.52%） ）wasalso the major distributed department. The specimens were mainly derived from sputum （51.61%） and bronchial lavage fluid （35.48% ）. 31 CRKP mainly showed additive and synergistic effects，with 67.74% and 22.58% ，respectively，and the combination effect of the two drugs was 9.68% with no antagonistic efect. ConclusionKPN biofilm isolated in this hospital had strong formation capacity and should attact clinical atention; theantibacterial effect of PMBandTGCin vitro was mainly synergistic and aditive to CRKP.

Key WordsKlebsiella pneumoniae; Carbapenemresistant; Biofilm; Polymyxin B; Tigecycline; Drug combination

據報道，肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，KPN）是全球醫院感染相關的主要細菌病原體之一[]。碳青霉烯類藥物的廣泛應用，促使耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantK.pneumoniae，CRKP）的出現并廣泛傳播，CRKP長期以來一直是臨床抗菌感染中的一個棘手問題[2-3]，1988年LeChevallier等[4]首次描述了KPN和生物膜形成現象，KPN形成生物膜后，黏附于各類醫療器材引起傳播，膜內細菌受到保護可在惡劣環境中長時間存活，逃避宿主免疫防御同時也使細菌具有更高水平的耐藥性。Alcantar-Curiel等[5]的一項研究提出，抗生素耐藥性和細菌形成生物膜的能力在肺炎克雷伯菌的全球傳播中發揮重要作用，生物膜作為細菌耐藥的一種重要機制，但目前其形成能力與肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物敏感性關系的相關研究較少。因此，本研究選取住院患者送檢標本中分離培養并鑒定的KPN為研究對象，檢測生物膜形成能力及統計分析其分布情況，探究生物膜形成能力與碳青霉烯類抗生素敏感性的關系，以期為醫院感染的控制提供理論依據。有相關研究表明，多黏菌素B（polymyxinB，PMB）和替加環素（tigecycline，TGC）似乎是治療CRKP感染的最后選擇，但仍需要考慮幾個因素，如腎毒性、體內可用血漿濃度和治療期間耐藥性的增加[4-5]，這給臨床治療帶來極大的挑戰，因此，聯合用藥成為最佳選擇，我們采用體外聯合藥敏試驗了解PMB與TGC聯合使用是否能在體外有效抑制細菌生長。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 標本來源

收集本院2022年10月—2023年10月臨床分離的KPN菌株，剔除同一患者的重復菌株，采用紙片法將菌株保存于 -80°C 冰箱。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2 儀器與試劑

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀、比濁儀、VITEK-2Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統、VARIOSKANLUX酶標儀、細菌培養箱。血平板購自鄭州安圖生物股份有限責任公司；MH瓊脂粉購自杭州濱河微生物試劑有限公司；96孔細胞培養板購自廣州浩特生物過濾股份有限責任公司；藥敏卡購自法國Bio-Mereiux公司；替加環素購自上海源葉生物科技有限公司；多黏菌素B購自四川省維克奇生物科技有限公司；結晶紫染液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.1.3 實驗試劑配制

（1）MH肉湯培養基在電子天平上稱取 10.5g MH肉湯粉，加入廣口帶蓋玻璃瓶，用蒸餾水定容至 500mL 攪拌完全溶解，貼上滅菌指示帶并標注日期，高壓蒸汽滅菌 121° ， 103.4kPa）15～20min 后取出放置于室溫，冷卻后封口儲存于 4°C 冰箱保存。

（2）抗菌藥物濃度制備參照美國2021CLSIMS-100^[6] ，分別于電子天平上準確稱取PMB、TGC粉末25.6mg ，均充分溶解于 10mL 無菌去離子水中配成抗菌藥物濃度母液 2560μg/mL 。再進行相應稀釋配成最終濃度分別為 256μg/mL 的抗菌藥物濃度，使用無菌EP管分裝溶解后的藥物，并在注明藥物名稱，儲存于 -80^°C 冰箱中備用，儲存期限 lt;6 個月，所有藥物溶解后在說明書規定時間內使用。

（3） 0.1% 結晶紫配制在無菌操作臺上用電子天平秤取0.1g結晶紫，溶于 100mL 生理鹽水中，混勻后， 4^°C 冰箱保存備用。

（4） 33% 冰醋酸溶液配制的配制在無菌操作臺中，取兩只經過高壓滅菌的試管 （10mL ，各加入預先準備好的去離子水 4350μL ，再各加入 99.5% 冰醋酸溶液 1650μL ，震蕩混勻，使其終濃度 33% 。

1.2方法

1.2.1 菌株的凍存及復蘇

采用濾紙片凍存法，使用滅菌后的濾紙片刮取固體培養基上3～5個單菌落，將其置入凍存管內密封；凍存管上標識好菌株的名稱及留取時間后放入 -80^°C 冰箱，長期保存。菌株復蘇，將菌株從冰箱中取出，在室溫下平衡 15～20min ，用無菌鑷子夾取帶有菌株的濾紙片，將有細菌的一面涂布于培養基的一區，濾紙片放回凍存管中繼續凍存；使用滅菌后的接種環，從涂布完成的一區開始進行三區畫線；將畫線后的平板倒置，放置于 35^°C±2^°C 的恒溫培養箱中培養 16～20h ，即可完成菌株的復蘇。

1.2.2結晶紫檢測生物膜的形成

用接種環挑取單個菌落于 5mL MH肉湯中，置于37°C 培養箱中增菌培養8～12h后，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至 1.5×10⁸CFU/mL ，并用MH肉湯將上述菌液進行1：100稀釋。吸取 200μL 菌液加入無菌96孔聚苯乙烯細胞培養板中，每株菌設置3個復孔，MH作為陰性對照。將96孔板置于 37°C 培養 48h 后，棄菌液，用純水沖洗3次，隨后每孔中加入甲醇 200μL 固定 15min ，棄廢液，晾干后加入 0.1% 的結晶紫染色 15min 后，用純水洗板，晾干，再加入 200μL 冰醋酸溶解結晶紫后，測定 620nm 的吸光度值。結果判定：陰性對照的平均值加標準差定義為 A_c ，以測量值為A，取實驗組3孔的平均值A值與 A_c 比較。生物膜形成分為4類：強陽性 （+++） ： Agt;4×A_c 中等陽性 （++） ： 2×A_cc ；弱陽性 （+） A_c c ；陰性 （-） ： A?A_c 。

1.2.3微量肉湯稀釋法測定抗生素的最低抑菌濃度 （minimum inhibitory concentration，MIC）

打開無菌的96孔板，在A1-H1孔加入 200μL 的藥液，然后在A2-H11的所有孔中加入 100μL 的MH;在每一豎排的第1個孔中吸取 100μL 藥液加入第2個孔，用移液槍反復吹打混勻后，再吸取 100μL 到第3個孔，重復此操作一直到第11個孔混合完成后，吸取100μL 棄去；再向各A1-H11孔中加入 100μL 稀釋后的菌液，同時做陰性對照和空白對照，在A2-D12孔中加入 200μL 的MH作為陰性對照，在E12-H12孔中加入 200μL 濃度的菌液作為陽性對照。

MIC結果判讀：將接種好的96孔板標記后置于37°C 恒溫培養箱中，培養16～20h后取出將96孔板置于黑色不透光的背景下進行結果觀察（所有藥敏結果必須在質控結果處于正常范圍內時才算有效）與陰性對照孔MH對比，沒有細菌生長的孔對應的最低藥物濃度為該菌株的MIC值。

1.2.4棋盤稀釋法聯合藥敏

將抗菌藥物PMB與TGC進行聯合用藥，PMB倍比稀釋 4×MIC～1/16×MIC ，共7濃度，TGC倍比稀釋 ：4×MIC～1/128×MIC ，共10濃度。需要注意的是，不同濃度梯度的PMB均為手動加入，因此需要在配藥時直接進行倍比稀釋為后續加樣備用，而TGC是在96孔板中用排槍倍比稀釋，因此不必提前稀釋。將96孔板中每孔加入 50μL 肉湯；A11～H11依次加入 50μL 最高濃度的甲藥，然后用排槍從右向左倍比稀釋至A2～H2列；A1～A11手動加入 .50μL 最高濃度的乙藥，B1-B11手動加入 50μL 第二個倍比稀釋濃度的PMB，以此類推CDEFG行也依次手動加入倍比稀釋后的PMB，每行的PMB藥物濃度均相同；除H1外每孔均加入制備的菌懸液 100μL ，H1為本試驗的空白對照孔。

結果讀取與FICI判定標準：將接種好的96孔板標記后置于 37^°C 恒溫培養箱中，培養16～20h后取出將96孔板置于黑色不透光的背景下進行結果觀察（所有藥敏結果必須在質控結果處于正常范圍內時才算有效）與陰性對照孔MH對比。96孔板最左側一列測PMB單藥MIC，最下面一行測TGC單藥MIC，最右側一列設置陰性和陽性對照。以兩藥聯合區域內液體澄清的孔所對應的藥物濃度為兩藥聯合的MIC值，最后計算聯合抑菌指數（fractional inhibitoryconcentrationindex，FICI）來評價兩藥的聯合效應，最小值即為組合的FICI值。FICI=MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用 + MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用。FICI ?0.5 為協同作用， 0.52.0 為拮抗作用。

抗菌藥物藥敏折點參考CLSI-2021版推薦，PMBMIC ：?2mg/L 為敏感， MIC?4mg/L 為耐藥。由于CLSI無TGC對肺炎克雷伯菌的MIC折點的解釋標準，本實驗TGC藥敏折點參照美國食品藥品監督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）對大腸桿菌的MIC折點標準，TGCMIC ?2mg/L 為敏感，M IC?8mg/L 為耐藥。標準菌株ATCC25922質控范圍 （μg/mL） ）：TGC（0.003～0.25），PMB（0.25～2）。

1.2.5 統計學處理

采用Exce12019進行基本數據整理，采用SPSS27.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以 表示；計數資料以例數或率表示，組間比較采用γ檢驗，以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1菌株生物膜形成能力檢測結果

對吸光度值數據分析顯示，在收集的66株KPN中，僅有6株 （9.09%） 為形成生物膜，其余均可形成生物膜，其陽性率為 90.91% 。生物膜陽性菌株的主要標本類型為痰液（ 60% ，36/60）、支氣管灌洗液（ 18.33% ，11/60）和中段尿 10% ，6/60），具體見圖1。

主要科室分布于ICU重癥監護病房 （36.67% .24/60）、保健病房（ 13.33% ， 8/60AA 神經外科 10% 6/60）、神經內科 （6.67% ，4/60），具體見圖。分離自ICU重癥監護病房的菌株有 91.67% 能形成生物膜，具體見圖2。

2.2菌株生物膜形成能力評估

研究發現，66株KPN中，生物膜強陽性占24.24%（16/66） 、中等陽性占 46.97%（31/66） 、弱陽性占19.70%（13/66） 、陰性占 9.09%0%（6/66） 。生物膜陽性對照（ATCC25922）吸光度值為 0.046±0.006 ，具體見表1。

圖160株生物膜形成陽性菌株的標本類型分布情況 Fig.1Specimen-type distribution of 60 biofilm-forming positive strain

圖260株生物膜形成陽性菌株的科室分布情況Fig.2 Departmental distribution of the 60 biofilm-formingpositive strains

KPN生物膜形成與碳青霉烯類抗生素敏感性關系如圖3、表2所示，31株CRKP生物膜生成率為 93.55%（29/31） ，35株CSKP生物膜形成率為88.57%（31/35） 。通過統計分析，CRKP組與CSKP組生物膜形成能力無明顯差異 （Pgt;0.05） 。

2.3 CRKP菌株分布情況

共采集31株非重復CRKP臨床分離株，年齡為34～87歲（中位數73歲），其中男性占（ 77.42% .24/31），大部分分離株來自ICU（ 64.52% ，20/31），其余分離株來自保健病房（ 12.90% ，4/31）、神經外科 9.68% ，3/31）等其他，標本主要來源于痰液（ 51.61% ，16/31）和灌洗液（ 35.48% ，11/31），其次為尿液 （6.45% ，2/31）和血液標本（ 6.45% ，2/31）。

2.4 CRKP對PMB和TGCMIC分布情況

共采集31株CRKP臨床分離株，其中27株對PMB敏感 （87.10% ，4株 （12.90% 為耐藥株，PMB的MIC分布寬度為 10.5～4mg/L ，MIC分布如圖4。

共采集31株CRKP臨床分離株，其中21株對TGC敏感 （67.74%） ，6株 （19.35% ）為TGC耐藥株，TGC的MIC值分布范圍由 1～16mg/L ，MIC分布如圖5。

Tab.1The biofilm formation ability of K. pneumoniae （A₆₂₀）

續表1

表1肺炎克雷伯菌生物膜形成能力 （A₆₂₀）

注： ^°+++ ”表示強陽性， ODgt;4×ODC ；“ ⁺⁺ ”表示中等陽性，2×ODClt;od ?4×=\"\" odc；\"=\"\" Π+Π′′=\"\" 表示弱陽性，odclt;2×=\"\" odc;“一”表示陰性，=\"\" 。

圖3CRKP組與CSKP組生物膜形成情況 Fig.3Biofilm formation in the CRKP and CSKP groups

表2不同耐藥情況菌株的生物膜形成能力

Tab.2Biofilm formation capacity of strains with different resistance conditions

2.5聯合藥敏結果

2.5.1藥物單獨使用和聯合應用的MIC值比較31株CRKP分離株單藥和聯合用藥分析顯示，大

注：PMBMIC值 ?2mgL 為敏感，MIC值 為耐藥。圖431株CRKP多黏菌素BMIC值分布情況Fig.4 Distribution ofMIC values of31 CRKP polymyxinB

多數菌株聯合用藥的MIC值與單一用藥相比時有所降低，PMB-TGC組合中使PMB的MIC值最高減少了1/16，TGC的MIC值最高減少了1/4（表3）。

2.5.2PMB聯合替加環的FICI數值分布

主要表現為相加作用與協同作用，比例分別為67.74%（21/31） 與 22.58%（7/31） 。兩藥聯合無關作用比例為 9.68%（3/31） ，未出現拮抗作用（表4）。

3討論

生物膜是嵌入在胞外聚合物中的復雜微生物群落，并黏附在生物或非生物表面，生物膜在表面的形成經歷了細胞的黏附、小菌落的形成、成熟和最終作為活細胞的繁殖[7]。生物膜的形成是肺炎克雷伯菌一個重要的毒力性狀，66株KPN9 10.91% 的分離株可形成生物膜，僅有6株 （9.09%） 未形成生物膜，相比之下，本研究結果高于林偉苗等[8報道生物膜陽性株37.1% 的檢出率和Karimi等[9報道的KPN分離菌株生物膜陽性率為 75% ，出現差異的原因可能是本研究收集的臨床樣本與其他研究者存在一定的差異，也有研究表明，只要環境條件適宜，幾乎所有細菌都能夠形成生物膜[10]，因此，體外實驗中細菌培養環境對生物膜形成影響較大。另一方面Seif等[1的研究結果顯示，94株肺炎克雷伯菌中， 93.60% 的分離株形成生物膜這與本研究結果相近。菌株標本來源與生物膜形成之間的關系研究相對較少，結果顯示，在KPN生物膜形成陽性菌株中呼吸道分離株多于尿液、血液等其他標本，這與Nirwati等[12]和Seifi等[]的研究一致。而Ashwath等[13]研究了不同病區及不同樣本來源菌株生物膜形成能力的差異時，發現尿液菌株生物膜形成強于痰液。在住院患者中，尤其是ICU患者，形成生物膜的陽性率高于其他科室，其ICU中生物膜形成陽性率高的原因可能是大多數KPN感染與宿主細胞或非生物表面（如侵襲性操作）的生物膜形成有關[14]，ICU中患者感染嚴重，隨著廣譜抗生素使用頻率增加，且生物膜容易粘附在導尿管或醫療設備上，患者經常進行侵襲性操作這將會引起感染增加。提示臨床應密切關注ICU病房的感染情況，尤其是進行留置導管等侵入性操作患者的感染情況。

注：TGCMIC值 ?2mg/L 為敏感，MIC值 為耐藥。 圖5CRKP替加環素MIC值分布情況 Fig.5 Distribution ofMIC values ofCRKP tigecycline

31株CRKP生物膜形成率為 93.55% ，35株CSKP生物膜形成率為 88.57% ，生物膜形成率相較CRKP略高于CSKP，但統計分析發現兩組比較無統計學意義 （Pgt;0.05） ，這與Nirwati等[12]和deCampos等[15]報道的結果一致，一方面是因為每個分離株形成生物膜形成能力不同，其理化特性、成分之間的物理相互作用、生物膜附著的表面類型、溫度、PH值等都會影響其生物膜形成，如另一方面生物膜相對細菌而言起到一層屏障保護作用，通過減少抗生素的滲透性而降低其有效作用。吳雷[16認為碳青霉烯類耐藥菌株表現出較強的體外生物膜形成能力，這也增加了臨床耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌抗感染治療的難度，極易造成治療失敗和感染復發。目前對這一結論也只是推斷，尚無定論。

耐藥細菌引起的感染每年將會造成近7萬人死亡，預計到2050年這一數字將達到1000萬人[17]。為解決這一危機，已實施了若干國家和國際方案，包括歐盟的創新醫學倡議（IMI）、抗菌藥物耐藥性聯合規劃倡議（JPIAMR）和西班牙的國家抗藥性計劃（PRAN）[18]。其中提出的策略是通過結合兩種或兩種以上已知的抗菌藥物，這與單一使用抗菌藥物相比，縮短治療周期、增加其抗菌活性，這種方法的另一個優點是避免或盡量減少耐藥突變體的出現，Yu等[19]的研究發現，聯合用藥能夠有效改善臨床治療失敗的情況。在31株受試菌株中，有20株來自ICU病房，占總株數的 64.52% ，ICU病房分離CRKP比率占總株數的一半以上，這與上海某三甲醫院報道[2的一致，高于于夢[21]報道的重癥監護室分離菌株占 47.6% 。

Tab.3DistributionofMIC values of single and combined CRKP drugs in31 strains

表4CRKP多黏菌素B與替加環素聯合藥敏結果

表331株CRKP單藥及聯合用藥MIC值分布情況

Tab.4Drug susceptibility resultsofCRKP polymyxinB combined with tigecycline

通過棋盤滴定實驗發現，31株CRKP中大多數菌株聯合用藥的MIC值與單一用藥時相比較有所降低，PMB-TGC組合中使PMB的MIC值最高減少了1/16，TGC的MIC值最高減少了1/4，31株CRKP中PMB-TGC組合的相加作用占 67.74% ，無關作用占9.68% ，而兩者協同作用占 22.58% ，這種方案未出現拮抗作用。與Sun等[22]研究結果相似，以PMB為基礎抗生素，與TGC聯合具有很強的協同效應，PMB使TGC的MIC分別降低了1/8，但黃婉等[23]的研究顯示PMB聯合TGC組中協同作用僅為 9.3% ，與本研究中聯合用藥的協同作用占 22.58% 的結果存在差異，這可能是由于標本量，地域等因素及所用測試方法以及協同作用的解釋標準的存在差異。已有研究表明協同作用會根據所使用的試驗方法（時間殺菌曲線，E檢驗，棋盤協同試驗）不同而產生變化[24]。PMB與TGC聯合使用時顯示出協同作用的原因可能是破壞了由PMB引起的細菌膜的完整性，使TGC得以進入并達到最佳的殺菌效果[25]，這提示我們，若想要達到殺菌效果，在臨床實踐中可以考慮以上兩種抗菌藥物組合方案。盡管針對CRE的新抗生素正在研發中，但是預計在短時間內難以在臨床上使用，因此繼續研究現有抗生素并探索最有效的藥物組合是目前針對耐藥最有效的方法，但目前這些初步觀察只是體外實驗，它們在體內是否具有同樣的效果，還有待更多臨床研究的證實[26]。

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