氧化還原敏感夫西地酸載體連接前藥脂質(zhì)體的制備研究

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preparation of redox-sensitive fusidic acid carrier-linked prodrug liposomes

LiBingnan，Wang Zhicheng，Chen Qiuhong，Li Heng，Wei Guanqi，and Wang Qian （Chengdu University of Technology， Chengdu 610000）

Abstract Objective To prepare a new redox-sensitive fusidic acid carrier-linked prodrug liposome system with the aim of enhancing the encapsulation efciency of liposomes，reducing leakage，and strengthening the sensitivityof theredox environment to drug release withinthe bacterialcellenvironment.MethodsRedox-sensitive disulfide bond was used as a connecting bond to connect fusidic acid and cholesterol.The redox-sensitive fusidic acid prodrug liposomes（FSSC-LS） were prepared by the thin film dispersion method to connect the prodrug and phospholipid，using encapsulation eficiency as the evaluation index.The Box-Behnken Design response surface methodology wasutilized tooptimize theFSSC-LS formulation processThe invitro releaseofFSSC-LS using fusidic acid liposomes（FUS-LS）as a control was employed to evaluate its bacterial cel environment-responsive release effect.ResultsFSSC-LS prepared via the optimized formulation processexhibited a mean encapsulation efficiency of 94.61%±0.78% and drug loading of 7.95%±0.32% . The mean particle size and Zeta potential were 108.2nm and ?15.1mV， respectively. The results of the stability investigation showed that the leakage rate of FSSC-LS in 24h was 14.93% of that of FUS-LS at 4°C . In vitro release experiments revealed that the cumulative release rate of FUS-S-LS and FSSC-LS at 48h was 82.29% and 12.27% ，respectively， under simulated normal fluid environment conditions. Meanwhile， the cumulative release rate of FSSC-LS and FSSC-LS at 48h reached 81.37% and 91.39% ，respectively， under simulated intracellular release conditions of Escherichia coli（E.coli）.These resultsdemonstrated that FSSCLS exhibited good redoxrelease activity，withreduced release innormal fluid environments and enhancedrelease in E.coli.FSSC-LS efectivelyreleased fusidic acid in simulated bacterialcellenvironments.ConclusionInthis study， FSSC-LS withhigh encapsulation efficiencyand low leakagerate was successfullyprepared，demonstrating targeted release in response to the sensitive bacterial intracellular environment.This offered a new strategy to reduce systemic toxicity and enhance bacterial ability of drugs against sensitive bacteria.

Key WordsFusidic acid（FUS）;Fusidic acid prodrug（FSSC）;Liposomes;Response surface method;Release;Stability

隨著抗生素的廣泛使用，傳統(tǒng)給藥模式的問題逐漸顯現(xiàn)出來，如全身毒副作用，穩(wěn)定性差，靶部位藥物濃度及生物利用率低等[1-3]。目前對(duì)病原體內(nèi)環(huán)境敏感釋藥的抗生素納米粒載藥系統(tǒng)研究較少，且對(duì)于抗生素納米制劑的細(xì)菌體內(nèi)快速釋放藥物的研究目前還未見報(bào)道。另外抗生素對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌治療效果差，難以在胞內(nèi)富集，且難以殺傷胞內(nèi)存活細(xì)菌，導(dǎo)致慢性感染和復(fù)發(fā)性感染頻發(fā)[4]。同時(shí)抗生素的耐藥問題也日益嚴(yán)重，提高現(xiàn)有抗生素的療效，擴(kuò)大抗菌譜，老藥新用，也是抗生素研究的熱點(diǎn)問題[5-7]。

夫西地酸（fusidicacid，F(xiàn)US）是一種高效抗生素，對(duì)革蘭陽性菌，尤其是葡萄球菌具有高度敏感性，不易與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性，但對(duì)大多數(shù)革蘭陰性菌不敏感，抗菌譜相對(duì)較窄[8]。同時(shí)FUS水溶性差、穩(wěn)定性低、全身毒副作用大以及半衰期短，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

脂質(zhì)體（liposome，LS）是一種含水內(nèi)核和脂質(zhì)雙層球型囊泡，具有良好的生物相容性，可載帶親水和疏水性藥物，在制藥領(lǐng)域廣受關(guān)注9。脂質(zhì)體作為抗生素藥物載體，可提高藥物在炎癥部位局部濃度，抑制細(xì)菌誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)可減少給藥劑量，降低全身毒副作用[10-11]。研究表明，抗生素脂質(zhì)體的治療效果優(yōu)于游離藥物[12]。Nicolosi等[13]制備了FUS普通脂質(zhì)體，擴(kuò)大了FUS對(duì)革蘭陰性菌的抗菌譜。然而，該載藥脂質(zhì)體包封率有待提高，未解決儲(chǔ)存及用藥過程中藥物的泄漏問題，以及由此帶來的全身毒副作用問題。

二硫鍵（-S-S-）是氧化還原敏感化學(xué)鍵，在新型給藥系統(tǒng)和前藥設(shè)計(jì)中有較好的應(yīng)用前景[14-16]。革蘭陽性菌和陰性菌中含有一定濃度膽鹽水解酶（bile salthydrolase，BSH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH），均易使二硫鍵斷裂[17]；而人體體液環(huán)境和人體細(xì)胞環(huán)境GSH和BSH濃度較低，難以斷裂二硫鍵。通過在藥物和載體之間引入二硫鍵，制備載體連接前藥，進(jìn)一步制備載體連接前藥脂質(zhì)體，有望提高包封率、降低泄漏率；同時(shí)，載體連接前藥脂質(zhì)體只有到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)后，在高濃度BSH或GSH環(huán)境下二硫鍵斷裂轉(zhuǎn)變?yōu)樵帲拍軓闹|(zhì)體中釋放出來，有望降低脂質(zhì)體在體內(nèi)分布過程中的藥物釋放，達(dá)到藥物在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)快速釋放的目的[18-19]。

本文將FUS與膽固醇（cholesterol，CHOL）以二硫鍵進(jìn)行連接，合成FSSC，合成路線見圖1。然后以FSSC代替膽固醇，制備FSSC-LS，旨在提高包封率，降低泄漏率，達(dá)到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)快速釋放和降低FUS全身毒副作用的目的。

1儀器和試藥

1.1藥品和試劑

FUS（批號(hào)C14071728）、二硫代二丙酸（Dithiodipropionic acid，DTPA，批號(hào)C14071728）、CHOL（批號(hào)J2126326）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP，批號(hào)K2025119）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC1，BTSJ20220512]、二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC，BTSJ2019X01）、卵磷脂（批號(hào)E2125143）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，批號(hào)EZ7890C320）均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均 gt;98% ；色譜甲醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、冰乙酸均均購(gòu)置于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

圖1FSSC合成路線圖Fig.1Synthetic route of FSSC

1.2儀器

2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器公司）；HC-2518型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司）；TecnaiG2F20型透射電鏡（美國(guó)FEI公司）；DS-5510DT型激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）；EssentialLC-16型高效液相色譜儀（日本Shimadzu）;HZ150L型恒溫培養(yǎng)搖床（武漢瑞華儀器設(shè)備公司）;ThermoScientificQExactive型高分辨質(zhì)譜（美國(guó)ThermoScientific）；Alpha-1506型紫外可見分光光度計(jì)（上海譜元儀器公司）。

2方法和結(jié)果

2.1 FSSC的制備

精確稱量CHOL（ 99mg ， 0.26mmol ）、DTDP0 82mg ，0.39mmol）、EDCI（ 50mg ， 0.26mmol ）、DMAP（ 25mg ，0.21mmol）于茄形瓶中，加入15mL二氯甲烷溶解。 30^°C 下回流 24h ，薄層色譜（thin layerchromatography，TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析純化（二氯甲烷：乙酸乙酯 =6：1 ），純化得白色粉末CHOL-S-S-COOH89mg ，產(chǎn)率為 90.13% 。 ¹H NMR（ 400MHz ， CDCl₃. 85.37（dt， J=3.6 1.8Hz ，1H），4.71～4.58（m，1H），2.93（td，J=7.1 ， 1.7Hz ，4H），2.85～2.76（m，2H），2.71（t， J= 7.2Hz ，2H），2.37～2.29（m，2H），2.06～1.91（m，2H），1.88（p， J=3.1Hz ，1H），1.88～1.76（m，2H），1.67～1.40（m，4H），1.40～1.22（m，3H），1.24～1.04（m， 4H），1.02（d， J=16.1 Hz，0H），1.02（s，4H），1.00～0.92（m，1H），0.91（d， J=6.6 Hz， 3H）， 0.86（dd， J=6.6 1.8Hz ，6H），0.68（s，3H）。

圖2 CHOL-S-S-COOH'HNMRFig.2 CHOL-S-S-COOH'HNMR

CHOL-S-S-COOH的"¹H NMR（圖2）結(jié)果顯示5.37"ppm、4.71～4.58ppm處分別對(duì)應(yīng)于膽固醇a位和b位上2個(gè)氫的信號(hào)， 2.93ppm 、2.85～2.76 ppm和2.71ppm處分別出現(xiàn)三重峰，這是相鄰碳上氫原子之間的自旋偶合造成的共振峰裂分現(xiàn)象，說明二硫代二丙酸的4個(gè)亞甲基存在。通過核磁圖計(jì)算出CHOL-S-S-COOH上的膽固醇，DTDP的峰面積比，確定CHOL-S-S-COOH上的膽固醇，DTDP的摩爾比為1：1，結(jié)果說明CHOL-S-S-COOH的成功偶聯(lián)。

精確稱量中間體CHOL-S-S-COOH（150 mg，0.26 mmol）、FUS（100 mg，0.17 mmol）、DCC（80 mg，0.39mmol 和DMAP（ 50mg ， 0.41mmol 于茄形瓶中，加入 15mL 二氯甲烷溶解， 25°C 下磁力攪拌反應(yīng) 24h ，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度（石油醚：四氫呋喃 =3：1 ）反應(yīng)完畢后，減壓濃縮，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析純化（石油醚：四氫呋喃 ，純化得白色粉末FSSC78mg ，產(chǎn)率為 78% 。

FSSC的 ¹H NMR見圖3，由圖可知 5.88ppm 、5.16～5.04ppm 、 4.34～4.24ppm 、 3.44ppm 分別對(duì)應(yīng)于FSSC上a位、c位、e位、f位上的氫信號(hào)，均為FUS的特征峰；5.37和 4.63ppm 分別對(duì)應(yīng)于FSSC上b位和d位的氫信號(hào)，均為CHOL的特征峰。 2.99～ 2.87ppm 、2.81～2.67ppm分別對(duì)應(yīng)于FSSC上g位、h位、i位和j位的氫信號(hào)，均為DTDP上的4個(gè)亞甲基的特征峰。同時(shí)在FUS上e位上的醇羥基消失。在FSSC氫譜中，分別能找到FUS、DTDP和CHOL的特征峰相對(duì)應(yīng)。通過核磁圖計(jì)算出FSSC上的FUS，CHOL-S-S-COOH的峰面積比，確定FSSC上的FUS，CHOL-S-S-COOH的摩爾比為1：1，這些結(jié)果說明FSSC的成功偶聯(lián)。

圖3FSSC'HNMRFig.3FSSCHNMR

FSSC的 ¹³C NMR見圖4，由圖可知180～150 ppm對(duì)應(yīng)于FSSC羰基上的碳原子、 150～90ppm 對(duì)應(yīng)于FSSC烯烴上的碳原子、 90～10ppm 對(duì)應(yīng)于FSSC上的脂肪鏈碳原子和飽和碳原子。

圖4 FSSC ¹³C NMRFig.4 FSSC ¹³C NMR

HRMS（ESI） m/z： calcd for C₆₄H₉₉O₉S₂[M-H]^- 新1075.6731;found1075.6755，譜圖見圖5。

2.2.1FUS高效液相色譜分析方法的建立

FUS高效液相色譜檢測(cè)條件為：色譜柱HederaODS-2 （4.6mm×150mm ， 5μm） ；流動(dòng)相為甲醇：超純水 ；流速 1.0mL/min ；進(jìn)樣量 20μL ；柱溫30^°C ；檢測(cè)波長(zhǎng) 212nm 。

（1）專屬性（空白脂質(zhì)體、藥物，載藥脂質(zhì)體）

精密量取FUS溶液、空白脂質(zhì)體溶液和FUS-LS溶液 2mL 于 25mL 容量瓶，分別加入10倍量甲醇消解，流動(dòng)相稀釋定容，按照FUS高效液相色譜條件進(jìn)樣，得到對(duì)應(yīng)的色譜圖，結(jié)果見圖6。

從圖6中可看出FUS的保留時(shí)間為 11.21min ，峰型和分離度良好，脂質(zhì)體中包載材料及甲醇溶劑對(duì)FUS的測(cè)定無干擾，說明該方法專屬性良好。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線

將FUS溶液配制成濃度為2.0、10.1、20.2、40.4、80.8和 101.0μg/mL 的FUS溶液，按照FUS高效液相色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得線性方程 Y=10735X+3449.9 ， R²=0.9996 。結(jié)果顯示在 2.0～101.0μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

（3）精密度和準(zhǔn)確度

取 40.4μg/mL FUS溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示RSD為 0.38% ，說明建立的含量分析方法精密度良好。

圖5FSSC質(zhì)譜圖

Fig.5 MS spectrum ofFSSC

圖6（a）空白脂質(zhì)體、（b）FUS、（c）FUS-LS的HPLC圖

Fig.6HPLC chromatography of（a）Blank liposomes，（b）FUS，and （c）FUS-LS

分別取濃度為10.1、20.2和 40.4μg/mL FUS溶液，按照FUS高效液相色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率均在 98.0%～102.0% 范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度良好。

2.2.2 FSSC高效液相色譜分析方法的建立

FSSC高效液相色譜檢測(cè)條件為：色譜柱HederaODS-2 （4.6mm×150mm ， 5μm） ；流動(dòng)相為甲醇：超純水 =30：70（V/V） ；流速 1.0mL/min ；進(jìn)樣量 20μL ；柱溫30^°C ；檢測(cè)波長(zhǎng) 206nm 。

（1）專屬性（空白脂質(zhì)體、藥物，載藥脂質(zhì)體）

精密量取FSSC溶液、空白脂質(zhì)體溶液和FSSC-LS溶液 2mL 于 25mL 容量瓶，分別加入10倍量甲醇消解，流動(dòng)相稀釋定容，按照FSSC高效液相色譜條件進(jìn)樣，得到對(duì)應(yīng)的色譜圖，結(jié)果見圖7。

從圖7中可看出FSSC的保留時(shí)間為 7.92min ，峰型和分離度良好，脂質(zhì)體中包載材料及甲醇溶劑對(duì)FSSC的測(cè)定無干擾，說明該方法專屬性良好。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度為1.0、2.1、10.5、42.0、84.0和105.0μg/mL 的FSSC溶液，按照FSSC高效液相色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得線性方程 Y=10896X+1154.1 ， r²=0.9998 。結(jié)果顯示在1.0～105.0μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

（3）精密度和準(zhǔn)確度

取 42.0μg/mL FSSC溶液，按照FSSC高效液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示RSD為 10.63% ，建立的含量分析方法精密度良好。

分別取濃度為2.1、42.0和 84.0μg/mL FSSC溶液，按照FSSC高效液相色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率均在 98.0%～102.0% 范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度良好。

2.3脂質(zhì)體包封率和載藥量的測(cè)定

取 200μL 載藥脂質(zhì)體于 ?5mL 容量瓶中，加入 3mL 甲醇 50Hz 超聲 5min 破乳定容，按“2.2”項(xiàng)下確定的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得總藥量 （W₀） 。同時(shí)取200μL 載藥脂質(zhì)體通過葡聚糖G-50凝膠柱分離，分離后的脂質(zhì)體 40^°C 減壓旋蒸濃縮至約 200μL ，加 λ3mL 甲醇 50Hz 超聲 5min 破乳定容至 5mL ，進(jìn)樣測(cè)定，得脂質(zhì)體包封藥量 （W₁） ，設(shè)制備脂質(zhì)體時(shí)載體材料的投入量為 。分別按公式1和公式2計(jì)算包封率和載藥量。

包封率 載藥量

式中 W₁ 為包封藥物的質(zhì)量， W₀ 為總藥物的質(zhì)量， 為制備脂質(zhì)體時(shí)載體材料的投入量。

2.4脂質(zhì)體的制備

2.4.1 FUS-LS的制備

采用薄膜分散法，制備FUS-LS。分別量取 2.5mL 卵磷脂溶液 （2.0mg/mL ， 0.5mL FUS溶液 1.0mg/mL 0和 10.5mLCHOL（1.0mg/mL） 溶液于圓底燒瓶中， 40°C 減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑形成均勻薄膜；加入2.5mLpH7.4PBS緩沖液， 30^°C 水合 6min ，冰水浴下探頭超聲5min（功率 360W ，工作 2s ，休息3s），制備得到FUS-LS。包封率為 75.37% ，載藥量為 16.28% 。

2.4.2 FSSC-LS的制備

除采用FSSC代替FUS和部分膽固醇膜材外，F(xiàn)SSC-LS的制備方法同F(xiàn)US-LS。

圖7（a）空白脂質(zhì)體、（b）FSSC、（c）FSSC-LS的HPLC圖 Fig.7HPLC chromatography of（a） Blank liposome，（b） FSSC，and（c） FSSC-LS

（1）FSSC-LS處方優(yōu)化

通過前期單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化FSSC-LS處方工藝。以包封率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇脂藥比（磷脂：FSSC）、膜材比（磷脂：膽固醇）、水合體積3個(gè)主要影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，使用Box-BehnkenDesign進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，篩選最優(yōu)處方。具體水平設(shè)置見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化分析

利用Design-expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到最優(yōu)擬合方程，該方程式為： 0.6150A+3.24B+1.85C+1.49AB+1.61AC-0.1950BC+0.1950BC-0.185A 16.40A²-10.12B²-0.7740C² 模型： Plt;0.05 ，變異系數(shù)CV為 2.23% ， R²gt;0.9872 表明該方程擬合充分。該模型可用于篩選確定FSSC-LS最佳處方制備條件。

表1因素與水平表 Tab.1 Factors and levels

表2響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

Tab.2Experimental design and results of the response surface method

通過Design-expert軟件得到3個(gè)影響因素之間的3D交互作用曲面圖，分析不同影響因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，結(jié)果見圖8所示，隨著脂藥比、膜材比、水合體積的增加，包封率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。包封率與脂藥比的關(guān)系存在一個(gè)極值點(diǎn)，脂藥比過高過低均不好；包封率與膜材比之間的關(guān)系也存在極值點(diǎn)，取中間值較好；水合體積也顯示取中間值較好。對(duì)各因素進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到最優(yōu)處方為脂藥比 （A） 為10.19：1，膜材比 （B） 為10.77：1，卵磷脂濃度為 1.25mg/mL ，F(xiàn)SSC濃度為 10.12mg/mL ，水合體積為 2.5mL ，膽固醇濃度為 0.13mg/mL ，包封率預(yù)測(cè)值為 95.78% 。

（3）處方驗(yàn)證

按最優(yōu)處方工藝平行制備3批FSSC-LS，樣品的平均包封率為 94.61%±0.78% ，與理論預(yù)測(cè)值 95.78% 接近，證明模型擬合成功，可用于FSSC-LS的處方優(yōu)化分析，結(jié)果可靠。

2.5 FSSC-LS質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 表面形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscopy，TEM）觀察FSSC-LS的形貌及分布。采用磷鎢酸負(fù)染法制備樣品，取適量FSSC-LS溶液，滴加至銅網(wǎng)上，放置 15min ，再次滴加適量磷酸鎢負(fù)染液，放置 5min ，TEM下觀察脂質(zhì)體的形貌，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，F(xiàn)SSC-LS均呈現(xiàn)較為規(guī)則的類球形結(jié)構(gòu)，且粒徑大小較為均一。

2.5.2 粒徑及Zeta電位

取適量FSSC-LS混懸液，馬爾文激光粒度儀（DLS）測(cè)定其粒徑和Zeta電位，結(jié)果見圖10～11所示。FSSC-LS平均粒徑為 108.20nm ，PDI為0.235，Zeta電位為- .15.1mV 。同時(shí)將制備的FSSC-LS（圖12）于 4°C 下存放，DLS測(cè)量0～7d平均粒徑和多分散指數(shù)（PDI，見圖13。由圖13所示，F(xiàn)SSC-LS在0～7d粒徑和PDI變化較小，證明制備的FSSC-LS較為成功。

2.6脂質(zhì)體體外釋放

采用反向透析法考察FUS-LS和FSSC-LS在正 常細(xì)胞外環(huán)境和大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)的釋放行為。

Fig.8The response surface and contour plots

圖8響應(yīng)曲面圖及等高線圖

圖9FSSC-LS透射電鏡圖Fig.9TEMofFSSC-LS

圖11FSSC-LSZeta電位Fig.11 FSSC-LS Zeta potential

圖10FSSC-LS粒徑分布Fig.10 FSSC-LS particle sizedistribution

圖12FSSC-LS丁達(dá)爾效應(yīng) Fig.12TheTyndall effect ofFSSC-LS

圖130～7dFSSC-LS粒徑和PDI變化曲線 Fig.13 FSSC-LS particle size and PDI change curves

選用含 的DTT的磷酸鹽緩沖液 （pH7.4 1% SDS）為模擬正常細(xì)胞外環(huán)境釋放介質(zhì)，記為釋放介質(zhì)1；選用含5mmol/LDTT的磷酸鹽緩沖液（pH5.4， 1% SDS）為模擬大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境釋放介質(zhì)，記為釋放介質(zhì)2。取 2mL 制備的脂質(zhì)體溶液于200mL 釋放介質(zhì)中，將裝有 3mL 釋放介質(zhì)的透析袋（Mw=8000～14000Da）夾緊后置于恒溫培養(yǎng)搖床中（溫度 37^°C ，分別于0.5、1、2、4、8、12、24和48h精密吸取 200μL 透析袋中樣品并補(bǔ)充等體積空白釋放介質(zhì)，樣品按“2.2.1和2.2.2”項(xiàng)下確定的色譜條件，進(jìn)樣含量測(cè)定（當(dāng)FSSC-LS在釋放介質(zhì)2中，高濃度DTT使FSSC二硫鍵斷裂形成巰基，硫元素上的孤對(duì)電子進(jìn)攻羰基，酯鍵斷裂，還原成醇，F(xiàn)SSC在5mmol/LDTT中釋放的HPLC色譜圖，見圖14）[20]，計(jì)算各取樣點(diǎn)藥物釋放量和累積釋放百分率 （Q%）^[21] ，以時(shí)間為橫坐標(biāo)， Q% 為縱坐標(biāo)，得到FUS-LS和FSSC-LS釋藥曲線，見圖15。

注：a-峰為FSSC；b-峰為FUS。 圖14FSSC釋放HPLC圖 Fig.14 HPLC chromatography of FSSC release

由圖15可知，在正常細(xì)胞外環(huán)境中，F(xiàn)US-LS48h Q% 達(dá)到 82.29% ，而FSSC-LS48h Q% 只有12.27% ，僅為FUS-LS的 15% ；結(jié)果證明，通過制備載體連接前藥，大大提高了FSSC-LS在轉(zhuǎn)運(yùn)分布過程中的穩(wěn)定性，極大地減少了脂質(zhì)體在細(xì)菌細(xì)胞外藥物釋放，有利于降低FUS的全身毒副作用和提高藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的量。在模擬大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下，F(xiàn)US-LS48h Q% 為 81.37% ；而FSSC-LS 48h Q% 達(dá)到 91.39% ，是在正常細(xì)胞外環(huán)境中的7.4倍，顯示制備的FSSC具有一定的大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)快速釋藥特性。以上結(jié)果證明將FUS與膽固醇偶聯(lián)制備成載體連接前藥FSSC，制備得到的FSSC-LS具有較好的大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)快速釋藥作用，有望降低FUS全身毒副作用，達(dá)到提高FUS對(duì)大腸埃希菌等敏感細(xì)菌抗菌能力的目的。

圖15FUS-LS和FSSC-LS體外釋放曲線 Fig.15 In vitro release curves ofFUS-LS and FSSC-LS

表3FSSC-LS脂質(zhì)體釋放曲線方程擬合 Tab.3FSSC-LS liposome release curve equation fitting

對(duì)FSSC-LS的體外釋藥曲線分別進(jìn)行零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Higuchi方程進(jìn)行擬合。結(jié)果見表3（其中 Q 為累積釋放量，t為釋放時(shí)間）。由表3可知，在模擬正常細(xì)胞外環(huán)境條件下，F(xiàn)SSC-LS體外釋放行為以Higuchi方程擬合較好，藥物釋放為擴(kuò)散和骨架溶蝕并存。而在模擬大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境釋放介質(zhì)條件下，F(xiàn)SSC-LS釋藥行為更符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。

2.7脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

取FUS-LS和FSSC-LS于 4°C 下存放，分別于0、0.5、1、2、4、6、8、12和24h精密吸取 400μL 樣品，按“2.3”項(xiàng)下脂質(zhì)體包封率和載藥量的測(cè)定方法處理樣品，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下確定的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算泄漏率。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，泄漏率為縱坐標(biāo)。其中泄漏率 =（EE-EE_i/EE）×100%（EE 指脂質(zhì)體初始包封率， EE_i 指儲(chǔ)存一段時(shí)間后脂質(zhì)體包封率），得到FUS-LS和FSSC-LS泄漏率曲線，見圖16。

由圖16可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，2種脂質(zhì)體泄漏率逐漸增大，但是FSSC-LS的泄漏率明顯低于FUS-LS。 4^°C 條件下，F(xiàn)SSC-LS 24h 泄漏率是FUS-LS的14.93% 。因此將FUS與膽固醇偶聯(lián)制備成載體連接前藥FSSC能有效降低FUS-LS泄漏率。

3結(jié)論

本文將FUS和膽固醇以二硫鍵為連接鍵，制備了載體連接前藥，并進(jìn)一步制備FSSC-LS，其具有較高包封率和良好的穩(wěn)定性。在模擬正常細(xì)胞外環(huán)境條件下FSSC-LS的 Q% 遠(yuǎn)低于FUS-LS，而在模擬敏感菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下，F(xiàn)SSC-LS釋藥達(dá)到91.39% 。顯示制備的FSSC-LS具有較好的敏感細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境藥物釋放響應(yīng)性，有望提高FUS的在細(xì)菌細(xì)胞環(huán)境釋放速率，增強(qiáng)其抗菌作用。課題設(shè)計(jì)制備的氧化還原敏感夫西地酸載體連接前藥脂質(zhì)體有望為降低抗生素全身毒副作用和提高抗菌能力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

圖16FUS-LS和FSSC-LS泄漏率曲線 Fig.16LeakratecurvesofFUS-LSandFSSC-LS

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