乙酰唑胺對小鼠動脈粥樣硬化斑塊及其鈣化作用

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化；血管鈣化；碳酸酐酶II；乙酰唑胺；小鼠，近交C57BL[中圖分類號] R361.1；R977.3 ［文獻標志碼］A [文章編號] 2096-5532（2025）03-0376-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2025.61.093 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）][網絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250724.1505.003；

2025-07-24 17：42：05

Effects of acetazolamide on atherosclerotic plaque formation and calcification in miceLIU Han ，AN Yi （Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266oo3，China）

[Abstract]ObjectiveToinvestigate the efects of acetazolamideonatherosclerotic plaque formationand vascularcalcification in mice. MethodsFour-week-old Apoe^-/-（n=3） and wild-type （ n=3 ） C57BL/6 mice were fed for 21 weeks，and subsequently，body weight and serum lipid levels were compared. Twelve l2-week-old Apoe^-/- mice were divided into control group （ n=8 ，given normal saline） and experimental group （ ，given acetazolamide at 40mg/kg .After 2 weeks of treatment，aortic tissues wereharvestedtoevaluate plaquearea withHEstaining，characterizelipidcomposition withOilRedOstaining，measure calcium content using calcium assay kits，and determine the expression of carbonic anhydrase I （CA2）by Western blot. Results Apoe^-/- mice exhibited significantly higher body weight and serum lipid levels than wild-type mice （F=24.15-61.24，t=2.891- 7.229，Plt;0.05） . At 3 months of age， plaque area，calcium content，and CA2 expression in aortic tissues were significantly increased in Apoe^-/- mice （t=2.872-13.360，Plt;0.05） .Compared with controls，acetazolamide-treated Apoe^-/- mice showed significantly reduced CA2 expresson，lipid-rich necrotic core area，and calcification severity （t=3.820-9.701，Plt;0.05） .ConclusionAcetazolamide attenuates atherosclerotic plaque formationand caleification by suppressing CA2 expressioninmice.

[Key words]atherosclerotic；vascular calcification；carbonic anhydrase II；acetazolamide；mice，inbred C57BL

冠心病是一種常見的心血管疾病，其病因是動脈粥樣硬化斑塊形成導致的血管狹窄與血管鈣化，全球每年因其而死亡病人高達1700萬[1]。血管鈣化是疾病進展的關鍵標志，與斑塊不穩定性密切相關[2-4]。研究表明，碳酸酐酶Ⅱ（CA2）可通過催化碳酸氫鹽形成促進鈣鹽沉積，在血管鈣化中發揮潛在作用[5-6]。一項個體比較研究顯示，CA2 在動脈粥樣硬化斑塊中表達升高，其與血管鈣化也密切相關[8]。然而，CA2在動脈粥樣硬化斑塊鈣化中的調控機制尚未明確，且CA2抑制劑（如乙酰唑胺）能否干預鈣化過程仍有待驗證。因此，本研究以Apoe基因缺失 （Apoe^-/- ）小鼠為動脈粥樣硬化模型，通過體內實驗探究乙酰唑胺對主動脈斑塊組織CA2表達和動脈鈣化的影響，旨在為冠狀動脈斑塊形成和血管鈣化的藥物干預提供新的靶點。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物分別選擇1對品系為 C57BL/6 的4周齡 Apoe^-/- 模型小鼠及同周齡野生型（WT）小鼠進行繁育，種鼠均由賽業（蘇州）生物科技有限公司提供。小鼠分籠飼養，房間室溫保持 23～25°C ，環境明暗交替周期為 ^12h ，小鼠自由獲取飼料和水。小鼠實驗前適應環境1周。

1.1.2分組及給藥待模型小鼠繁育至12只、野生型小鼠至5只時可進行實驗。將模型小鼠分為兩組，其中對照組8只，實驗組4只。實驗組每2d給予乙酰唑胺 （40mg/kg） 尾靜脈注射1次，對照組注射等量生理鹽水，兩組均持續2周。

1.1.3主要試劑蘇木精-伊紅（HE）染液和油紅O染料均由賽維爾生物技術有限公司提供。兔源抗CA2一抗和羊抗兔CA2二抗均購于正能生物技術有限公司。RIPA裂解液和SDS-PAGE電泳液均購于上海雅酶生物醫藥科技有限公司。PVDF膜購于密理博中國有限公司。乙酰唑胺購于美國麥克化學公司。其他實驗試劑均為分析純，購自國產公司。

1.2 實驗方法

1.2.1組織切片和染色取小鼠主動脈組織，按照文獻的方法9進行組織標本固定、石蠟包埋、HE染色和油紅O染色。

1.2.2鈣離子（ ?Ca²⁺ ）含量檢測取小鼠主動脈組織剪碎，按照S1063S型鈣含量顯色檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書的步驟進行實驗操作。取裂解液上清進行BCA濃度測定，計算每微克蛋白中 Ca²⁺ 的質量，以質量分數表示。

1.2.3蛋白質免疫印跡（Western blot）檢測分別取動脈的斑塊組織和正常組織，按照文獻方法[10]進行組織裂解和Westernblot檢測。

1.3 統計學分析

使用GraphPadPrism9軟件對數據進行統計學處理。符合正態分布的計量資料數據以 表示，兩組均數比較采用獨立樣本 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗。采用雙因素重復測量方差分析評估野生型與模型小鼠體質量隨飼養時間的變化，在交互效應顯著的前提下進行簡單效應分析，并對 P 值進行Bonferroni校正。以Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2結果

2.1野生型和模型小鼠相關表型指標比較

重復測量方差分析顯示，兩型小鼠體質量比較的時間和組別主效應及其交互效應均顯著 （= 8 . 5 1 8 ， P 均 lt;0.05） °模型小鼠體質量在 _9～21 周齡均顯著高于野生型小鼠 （F_（1，4）=24.15～61.24 ，Bonferroni校正 P 均 lt; 0.05）。見圖 1A 。血脂分析顯示，模型小鼠血液中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白（LDL）均明顯高于野生型，而高密度脂蛋白（HDL）則顯著低于野生型 （t=2.891～7.229，P 均 lt;0.05） 見圖1B。與野生型小鼠相比較，模型小鼠斑塊面積與主動脈竇面積之比值（斑塊相對面積）為 （29.8± 3.8）% ，明顯高于野生型小鼠的 （0.8±0.2）% ，差異有統計學意義 （t=13.360，Plt;0.001） 。見圖1C和D。以上數據提示，動脈粥樣硬化模型的成功建立不僅表現為血脂異常，更直接表現為主動脈斑塊形成的病理特征，證實 Apoe^-/- 小鼠是研究斑塊鈣化的可靠模型。

2.2 兩型小鼠主動脈組織 Ca²⁺ 和CA2表達比較

模型小鼠主動脈組織中 Ca²⁺ 的質量分數為1.1±0.5 ，明顯高于野生型小鼠的 0.2±0.1 ，差異具有統計學意義 （t=2.872，Plt;0.05） 。見圖2。通過Protein Atlas數據庫（www.proteinatlas.org）分析CA2蛋白在心臟各類型組織細胞中的表達顯示，CA2蛋白在血管內皮細胞中具有較高的表達水平。Westernblot實驗檢測結果顯示，模型小鼠主動脈斑塊組織中CA2蛋白相對表達量為 （7.0±3.6）% .顯著高于野生型的 （1.0±0.1）% ，差異具有顯著性1 （t=2.937，Plt;0.05） 。見圖3A和B。以上數據表明，CA2蛋白表達水平與血管鈣化程度呈正相關，提示CA2可能通過促進鈣鹽沉積（如催化 HCO₃^- 與 Ca²⁺ 結合）參與斑塊組織鈣化的病理進程。

2.3 乙酰唑胺對主動脈斑塊組織CA2表達和鈣化程度影響

Westernblot檢測結果顯示，實驗組小鼠主動脈斑塊組織CA2蛋白相對表達量為 0.1±0.2 ，明顯低于對照組的 1.0±0.1 ，差異具有統計學意義（ ?_t= 9.701，Plt;0.001） 。見圖4。實驗組小鼠油紅O染色面積（脂質壞死核心面積）與主動脈根部面積之比（斑塊相對面積）為 （6.0±2.5）% ，明顯低于對照組的 （14.6±3.0）% ，差異有統計學意義（ .Plt;0.05） 。見圖5A和 B 。實驗組小鼠主動脈斑塊組織中 Ca²⁺ 含量顯著低于對照組 （Plt;0.01） 。見圖5C 。以上結果說明，乙酰唑胺可能通過特異性抑制CA2活性，阻斷鈣化反應，最終實現對斑塊組織鈣化與脂質沉積的干預，提示CA2可能是調控血管鈣化的關鍵靶點。

3討論

在全球范圍內，冠心病是一類高發且死亡率較

A：兩型小鼠不同周齡體質量比較;B：兩型小鼠血脂濃度比較;C：小鼠主動脈組織HE染色觀察（標尺長度 200μm ;D：兩型小鼠主動脈玟塊相對面積比較。WT：野生型小鼠； Apoe^-/- 0 Aρoe 基因缺失模型小鼠。 n=3 ;與野生型小鼠比較， ， ， ^***Plt;0.001 0

圖1野生型和模型小鼠相關表型指標比較

高的疾病，嚴重威脅人類的生命健康。冠心病主要發病原因是冠狀動脈粥樣硬化導致心臟血液供應不足[11-12]。因此，探究如何更好地抑制或緩解冠狀動脈硬化對冠心病的治療具有重要意義。冠狀動脈鈣化是其硬化發展到一定程度后的病理改變，主要表現為在硬化斑塊中有鈣鹽沉積。冠狀動脈鈣化往往被認為是疾病進展的表現，在一定程度上可定量反映冠狀動脈硬化的程度[13-14]

機體內的碳酸酐酶是一類能夠可逆催化 CO₂ 生成 HCO₃^- 離子的鋅酶，廣泛分布于紅細胞、腎小管上皮細胞、胃壁細胞、胰腺腺泡細胞、中樞神經細胞和睫狀體上皮細胞等[15]。碳酸酐酶家族具有多種同工酶，它們具有一定的組織特異性。在多種代謝活動中，碳酸酐酶均發揮重要功能，比如軟骨形成、纖維化和體液代謝等[16-17]。因此，碳酸酐酶表達或功能異常可引發多種疾病。研究已發現，碳酸酐酶是一種藥理性靶點，在臨床中碳酸酐酶抑制劑已被用于治療多種疾病，如青光眼、阻塞性睡眠呼吸暫停、高原疾病、癲癇和代謝堿中毒等[18-19]。由于碳酸酐酶可催化 HCO₃^- 離子的形成，而 Ca²⁺ 在細胞內可與其結合形成碳酸鹽沉淀[20]，因此，碳酸酐酶在血管鈣化中也發揮重要功能，但其對冠狀動脈鈣化的影響目前仍不清楚。此外，靶向CA2的藥理學干預能否在活體模型中逆轉鈣化進程，尚未得到系統驗證。本研究在 Apoe^-/- 小鼠模型中證實，乙酰唑胺干預2周后，主動脈斑塊鈣化程度顯著降低，同時脂質壞死核心面積顯著縮小，這一效應與CA2表達水平下降相關。該研究結果可能為臨床抗血管鈣化治療提供新的思路。

本研究以 Apoe^-/- 小鼠為動物模型，相關表型指標檢測顯示，相較于野生型小鼠，模型小鼠體質量增大更大，血脂濃度明顯升高，主動脈管壁顯著增厚且纖維成分明顯增多，呈現出顯著的主動脈粥樣硬化的表現。同時，模型鼠硬化的主動脈組織中 Ca²⁺ 水平明顯升高，表明組織鈣化參與主動脈硬化進程。Westernblot檢測結果表明，模型小鼠主動脈斑塊組織CA2表達水平顯著升高。由于碳酸酐酶可促進碳酸鹽沉淀的形成，因此，我們猜測冠狀動脈鈣化也可能與CA2表達水平上調和活性升高有關。為

A：兩型小鼠主動脈組織中CA2蛋白表達的電泳圖;B：兩型小鼠主動脈組織CA2蛋白相對表達量的比較。WT：野生型小鼠； Apoe^-/- Apoe 基因缺失模型小鼠。 ①～⑥ 為樣本編號。 n=3 ；與野生型小鼠比較， 。

圖3兩型小鼠主動脈組織中CA2蛋白表達的比較

A：乙酰唑胺對模型小鼠主動脈斑塊組織CA2蛋白表達影響的電泳圖;B：兩組小鼠主動脈斑塊組織CA2蛋白相對表達量的比較。 ① ～ ⑧ 為樣本編號。 n=4 ;與對照組小鼠比較， ^***Plt;0.001 。

圖5乙酰唑胺對模型小鼠主動脈斑塊面積和鈣化程度影響

A：兩組小鼠主動脈根部油紅O染色（標尺長度 200μm） 比較;B：兩組小鼠主動脈根部斑塊相對面積比較;C：兩組小鼠主動脈斑塊組糾Ca²⁺ 相對含量比較。 n=3 ;與對照組小鼠比較， ^**Plt;0.01 。

進一步明確該猜想，我們對模型小鼠進行了尾靜脈注射碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺干預的觀察。本研究結果顯示，乙酰唑胺可明顯下調模型小鼠主動脈斑塊組織CA2的表達；同時其主動脈斑塊組織鈣化水平明顯下降，斑塊的面積也明顯減小。

由于乙酰唑胺的治療機制在于阻斷鈣化過程的級聯反應，不同于臨床常用的雙膦酸鹽類藥物（主要通過吸附羥基磷灰石抑制鈣鹽沉積[21]），乙酰唑胺通過特異性結合CA2活性中心的鋅離子，抑制其催化 HCO₃^- 生成的能力，從而減少碳酸鈣沉淀的底物供應。值得注意的是，本研究還觀察到斑塊脂質核心縮小與CA2抑制顯著相關，提示CA2可能通過調節局部微環境pH值影響脂質氧化穩定性，這種效應在既往研究中尚未見報道。陳景娣等[22]的研究表明，乙酰唑胺在癲癇大鼠模型中通過調節血鉀、血鈣濃度減輕神經興奮性。然而，該效應源于全身性電解質平衡改變，并未涉及組織特異性機制。而本實驗在動脈粥樣硬化模型中揭示了乙酰唑胺選擇性作用于血管內皮富集的CA2，使斑塊局部 Ca²⁺ 濃度降低，表明其直接抑制血管鈣化而非全身鈣調節。本研究中CA2除了抑制動脈粥樣硬化斑塊鈣化外，還可同步減少斑塊脂質壞死核心面積，而此效應在癲癇模型中則未被觀察到。

從轉化醫學角度看，乙酰唑胺的應用價值主要體現在兩方面。首先是高危人群干預窗口前移。糖尿病和慢性腎病病人的冠狀動脈鈣化發生率較高，但現有干預手段多在鈣化晚期啟動。本研究在動物模型中實現了2周內快速起效，提示早期藥物干預可能阻斷亞臨床鈣化進展。其次是聯合治療策略優化。鑒于他汀類降血脂藥物可顯著降低斑塊組織脂質含量[23]，若與乙酰唑胺聯用，可能通過協同作用提升斑塊穩定性。其中，他汀類藥物可降低斑塊脂質核心破裂風險，而乙酰唑胺可降低斑塊的鈣化程度，二者聯合應用可靶向斑塊的不同病理組分。

綜上所述，本研究結果顯示，CA2在主動脈斑塊及其鈣化組織中高表達，而乙酰唑胺可通過下調CA2的表達而抑制主動脈斑塊面積增大及其鈣化程度，進而表現出良好的治療潛力，這有可能為冠心病的治療提供新的途徑。但是，本研究也存在一定局限性，例如觀察周期較短，長期用藥的安全性與耐受性也需進一步驗證；另外，未區分主動脈不同節段的鈣化敏感性差異，后續可結合Micro-CT分層進行更深入的分析。

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