丹皮酚調控NF-κB/HIF-1α信號通路抑制膀胱癌T24細胞遷移的作用及機制

中圖分類號R965 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1871-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.09

Effect and mechanism of paeonol in regulating NF- κκκ_κB/HIF -lαsignaling pathway to inhibit the migration ofbladder cancer T24 cells

AI Xinyao，CHEN Wenjia，CHEN Xi，WANG Yingzheng，WANG Yinghao，HUANG Meixia（Schoolof Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigatetheroleand mechanismof paeonolininhibitingthemigrationofbladdercancerT24 cells by regulating nuclear factor κB （NF- κB ）/hypoxia-inducible factor- 1α （HIF- ??l∝ ）-mediated aerobic glycolysis.METHODS T24 cells were divided into control group，cisplatin group （positive control， 3.001μg/mL ），and paeonol low-，medium- and high-dose groups（100，200， 400μg/mL ），respectively. After 24h of administration intervention，the effect of paeonol on the migration abilityofT24cellswasdetected（expressedbytecellscratchwoundhealingrate）.Theefectofpaeonolonthemitochondrial membranepotentialof T24celswasdetected（expressedbytheratioofred/green fluorescenceintensity）.Celularadenosine triphosphate（ATP）levelsand lactate content in T24celswere measured.The levelsof NF -κB/HIF-lα signaling pathway，the expressionofmigration-relatedproteins，andkeyenzymesinvolvedinaerobicglycolysisinthecellswerealldetermined. RESULTS Comparedwiththecontrol group，thecell scratch wound healingratesinthepaeonol medium-and high-dose groups and the cisplatin group were decreased significantly （Plt;0.01 ）；in the paeonol groups，the expression levels of NF- κB/HIF-1α signaling pathway-related proteins such as NF-κB and HIF- ??lα∝ ，migration-related proteins such as matrix metalloproteinase 2 （MMP2），MMP9，andvascularendothelial growth factor，aswellaskeyenzymes involved inaerobicglycolysissuchasglucose transporter1，hexokinase2andpyruvatekinaseisozymetypeM2，wereallreducedtovaryingdegrees inthecels，mostof these reductions showed statistically significant differences（ ?lt;0.05 or Plt;0.01 ）；the ratio of red/green fluorescence intensityin mitochondria of cells in the medium- and high-dose paeonol groups were significantly decreased （Plt;0.01 ）；theATP concentration

in cells of the paeonol high-dose group，and the lactate content in cells across all paeonol groups were significantly decreased 0 ΔPlt;0.05 or Plt;0.01 ）.CONCLUSIONS Paeonol significantly inhibits the migration of bladder cancer T24 cells，and its mechanism ofaction may be related to the inhibition ofthe NF- κB/ HIF-lα signaling pathway，and the down-regulation of keyenzyme activitiesinvolved inaerobic glycolysis.

KEYWORDSpaeonol；bladder cancer；NF-kB/HIF-lα signalingpathway；aerobicglycolysis；migration

膀胱癌是全球常見的泌尿系統惡性腫瘤，盡管手術聯合放化療可改善早期患者預后，但晚期膀胱癌易發生轉移與耐藥，導致治療失敗1。腫瘤轉移是一個多步驟的復雜過程，涉及細胞遷移、侵襲、血管生成及微環境重塑，而這一過程高度依賴腫瘤細胞的代謝重編程2]。其中，Warburg效應（即“有氧糖酵解”）是腫瘤代謝最顯著的特征之一，通過有氧糖酵解可增強葡萄糖攝取和乳酸生成，不僅為腫瘤細胞提供了快速的能量供應，還可酸化微環境以促進細胞侵襲、遷移[3]

Warburg效應的調控與缺氧誘導因子 1α （hypoxia-inducible factor- Π_1α ，HIF-1α）激活密切相關[4]。HIF- 1α 通過上調葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter1，GLUT1）及有氧糖酵解關鍵酶[如己糖激酶2（hexokinase2，HK2）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase isozyme typeM2，PKM2）]，驅動代謝并加速腫瘤進展[5。因此，靶向代謝重編程的關鍵節點來調控Warburg效應，可能成為抑制膀胱癌轉移的新策略。核因子 κB （nuclearfactorκB ，NF- σ_κB ）是調控腫瘤微環境的關鍵轉錄因子，其可通過調控促炎因子分泌維持腫瘤微環境穩態。最新研究表明， NF-κB/HIF-1α 的異常激活與腫瘤的轉移密切相關。在膀胱癌中， NF-κB/HIF-1α 信號通路異常激活，并通過調控缺氧應答和下游靶標共同加劇膀胱癌的化療耐藥性與腫瘤進展[]

丹皮酚是從中藥牡丹皮中提取的天然酚類化合物，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種藥理活性。有研究表明，丹皮酚可抑制NF- ?κBp65 核轉位及DNA結合活性，并通過抑制HIF- 及其下游信號進而抑制細胞的遷移和侵襲[]。然而，丹皮酚對腫瘤細胞中NF- ?κB. /HIF-1αα 信號通路的作用機制尚不明確，尤其是在膀胱癌T24細胞中，丹皮酚是否可以通過調控 NF-κB/HIF-1α 信號通路介導有氧糖酵解，進而抑制細胞遷移和侵襲，有待深入探索。本研究以膀胱癌T24細胞為模型，基于NF-KB/HIF-1α信號通路，探究丹皮酚對有氧糖酵解及細胞遷移的調控機制，以期為克服膀胱癌轉移及耐藥提供“多通路協同干預”的新治療策略。

1材料

1.1 細胞株

人膀胱癌T24細胞（貨號CL-0227）購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

Infinite？ 200Pro 型酶標儀購自瑞士Tecan公司；DM4000B型光學顯微鏡購自德國Leica公司；HeracellVIOS160i型 CO₂ 培養箱購自美國ThermoFisherScien-tific公司；Mini-PROTEANTetraCell小型垂直電泳槽、PowerPacTMHC型電泳儀、ChemiDocXRS+型化學發光系統均購自美國Bio-Rad公司。

1.3主要藥品與試劑

丹皮酚標準品（純度 ?98% ，規格 20mg ，批號24230817001）、細胞培養級二甲基亞砜（貨號D8371）均購自北京索萊寶科技有限公司；順鉑（貨號15663-27-1，純度 ?98% 購自上海源葉生物科技有限公司；1640完全培養基（貨號6124164）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ 0.25% ，貨號25200072）均購自美國ThermoFisherSci-entific公司；胎牛血清（貨號2346447）購自上海逍鵬生物科技有限公司； 100× 青鏈霉素混合液（貨號G4003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；CCK-8試劑盒（貨號CK001）購自北京蘭博利德生物科技有限公司；無血清培養液（貨號C40100）購自蘇州新賽美生物科技有限公司；乳酸比色法試劑盒（貨號E-BC-K044-M購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；增強型腺苷三磷酸（ad-enosinetriphosphate，ATP）分析試劑盒（批號A192250418）、增強型線粒體膜電位熒光探針（JC-1）檢測試劑盒（貨號C2003S）購自上海碧云天生物技術有限公司；鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔源血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、兔源基質金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase2，MMP2）、兔源MMP9、兔源GLUT1、兔源HK2、兔源PKM2、兔源NF- ??κB 抗體，辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G，HRP標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（批號分別為10029187、00113773、00121180、00140728、21829-1-AP、00126838、00132394、00024810、0100021451、0101102031）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔源HIF-1α抗體（批號14179S）購自美國CST公司。

2 方法

2.1丹皮酚及順鉑藥液的制備

精密稱取丹皮酚標準品 20mg ，加入 208μL 二甲基亞砜，充分混勻，配制成質量濃度為 96.154mg/mL 的丹皮酚母液；將母液分裝并于 -20^°C 保存，使用時用不含血清的培養基將其稀釋至 400μg/mL ○

精密稱取 3mg 順鉑標準品粉末于 1.5mL 離心管中，加入磷酸鹽緩沖液使其終質量濃度為 1800.600 μg/mL ，超聲溶解，即得；分裝后于 -20^°C 保存，使用時用不含血清的培養基將其稀釋至 3.001μg/mL 。

2.2 細胞培養

人膀胱癌T24細胞用1640完全培養基（含有 10% 胎牛血清）常規培養于 37°C、5%CO₂ 的細胞培養箱中，細胞貼壁生長至 80% 后，棄上清液，磷酸鹽緩沖液洗2遍后加入胰酶消化 2min ，加入培養基終止消化并重懸細胞，收集細胞至離心管，以 1200r/min 離心 3min ，進行傳代培養。取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.3 細胞分組與給藥

取“2.2”項下對數生長期的T24細胞，按照 5×10³ 個孔的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組（不含藥物，只含細胞）順鉑組（陽性對照，3.001μg/mL ，劑量參考文獻[11]設置）和丹皮酚低、中、高劑量組 （100，200，400μg/mL ，給藥濃度根據預實驗結果設置），各給藥組加入含相應藥物的基礎培養基，培養24h 后，進行后續實驗。上述實驗重復3次。

2.4 細胞遷移能力檢測

采用細胞劃痕實驗檢測。取“2.2”項下對數生長期的T24細胞，按照每孔 5×10⁵ 個接種于6孔板中，當細胞融合度 gt;90% 時，使用 10μL 移液管尖端在細胞單層上等距劃痕3次，磷酸鹽緩沖液清洗2遍；按照\"2.3\"項下分組處理細胞，并在同一位置下用倒置顯微鏡拍照記錄給藥 0.24h 時的劃痕圖片，利用ImageJ軟件計算細胞劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率 （%）=（0h 時劃痕面積一24h時劃痕面積）/0h時劃痕面積 ×100% 。

2.5 線粒體膜電位檢測

取“2.2\"項下對數生長期的T24細胞，按照每孔 2× 10⁵ 個接種于6孔板中，培養 24h 后棄去培養液。按照“2.3\"項下分組處理細胞 24h 后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入JC-1染色工作液 1mL 進行染色，并在 37^°C 下避光孵育 20min 。完成染色后，棄去上清液，用預冷的1×JC-1 染色緩沖液洗滌細胞2次，以確保去除未結合的染料。隨后加入 2mL 無血清培養液，將各組細胞置于熒光顯微鏡下檢測JC-1單體（綠色熒光）及JC-1聚合物（紅色熒光）的熒光強度并采集圖像。綠色熒光表示線粒體膜電位下降，紅色熒光表示線粒體膜電位正常。以紅綠熒光強度的比值反映線粒體膜電位的變化情況。

2.6 ATP濃度檢測

取“2.2”項下對數生長期的T24細胞，按照每孔 2× 10⁵ 個接種于6孔板中，培養過夜。按照“2.3\"項下分組處理細胞 24h 后，收集細胞并提取總蛋白。然后根據ATP分析試劑盒的說明書，對T24細胞的ATP濃度進行定量分析。

2.7 乳酸含量檢測

采用比色法檢測。按照“2.3\"項下分組處理細胞24h后，收集細胞并超聲破碎制備勻漿待測。嚴格按照試劑盒說明書步驟，在 530nm 波長處檢測吸光度值，計算細胞中的乳酸含量。

2.8NI F-κB/HIF-1α 信號通路、遷移相關蛋白以及有氧糖酵解關鍵酶表達的檢測

采用Westermnblot法檢測。按照“2.3\"項下分組（不設順鉑組）處理細胞，培養 24h 后，每孔加入 200μL 強裂解液裂解 10min ，以 12000r/min 離心 20min ，轉移上清液至新的離心管中。按照BCA試劑盒說明書方法測定蛋白濃度，將每個蛋白上樣量定量至 20μg 。上樣前，蛋白于 100^°C 變性 10min ，然后進行凝膠電泳、轉膜；封閉液封閉 20min 后，以TBST洗膜2次，每次 5min ，加入VEGF、MMP2、MMP9、GLUT1、HK2、PKM2、NF- κB FHIF- 1α GAPDH一抗（稀釋比例均為1：1000）， 4°C 孵育過夜；以TBST洗膜3次，每次 5min ，加入相應二抗（稀釋比例為 1：5000 孵育1h，以TBST洗膜3次，每次10min ；經ECL顯色、成像顯影后，采用ImageJ軟件分析，以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。上述實驗重復3次。

2.9 統計學分析

采用GraphPadPrism9.5軟件進行統計分析，計量資料滿足正態分布以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05 。

3結果

3.1丹皮酚對T24細胞遷移能力的影響

對照組、丹皮酚低劑量組、丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組、順鉑組細胞劃痕愈合率分別為！ （59.116± 4.127）%_?（33.587±1.617）%_?（23.322±3.826）%_?（25.257 1.316）% 、 （29.865±1.447）% 。與對照組比較，丹皮酚中、高劑量組和順鉑組細胞劃痕愈合率均顯著降低（ Plt; 0.01），提示丹皮酚及順鉑均具有抑制T24細胞遷移的作用。結果見圖1。

3.2丹皮酚對 NF-KB/HIF-1α 信號通路以及遷移相關蛋白表達的影響

與對照組比較，丹皮酚各劑量組細胞中HIF- （丹皮酚低劑量組除外）、MMP9、MMP2、NF σ_?κB VEGF蛋白表達水平均顯著降低 （Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表1、圖2。

3.3丹皮酚對T24細胞代謝的影響

3.3.1丹皮酚對T24細胞線粒體膜電位的影響

與對照組比較，丹皮酚中、高劑量組細胞線粒體紅綠熒光強度比值均顯著降低 （Plt;0.01 ）。結果見表2、圖3。

圖1各組T24細胞劃痕實驗結果（ ×10 ））

表1各組細胞中 NF-κB/HIF-1α 信號通路以及遷移相關蛋白表達水平比較 ）

a：與對照組比較， Plt;0.01 ；b：與對照組比較， Plt;0.05 □

圖2各組細胞中 NF-KB/HIF-1α 信號通路以及遷移相關蛋白表達的電泳圖

I：對照組；Ⅱ：丹皮酚低劑量組；II：丹皮酚中劑量組；V：丹皮酚高劑量組。

表2各組細胞線粒體紅綠熒光強度比值、ATP濃度、乳酸含量比較 ）

a：與對照組比較， Plt;0.01 ;b：與對照組比較， Plt;0.05 。

3.3.2丹皮酚對T24細胞ATP濃度、乳酸含量的影響

與對照組比較，丹皮酚高劑量組細胞ATP濃度以及丹皮酚各劑量組細胞乳酸含量均顯著降低 （Plt;0.05 或Plt;0.01 ）。結果見表2。

3.3.3丹皮酚對T24細胞有氧糖酵解關鍵酶表達的 影響

與對照組比較，丹皮酚中、高劑量組細胞中GLUT1，丹皮酚各劑量組細胞中PKM2，丹皮酚高劑量組細胞中HK2的表達水平均顯著降低 ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表3、圖4。

表3各組細胞中有氧糖酵解關鍵酶表達水平比較 n=3 ）

a：與對照組比較， ；b：與對照組比較， .Plt;0.01 。

4討論

膀胱癌作為全球最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，其高復發率和侵襲性進展傾向對臨床治療構成了嚴峻挑戰[2]。在腫瘤發生發展過程中，細胞高度增殖導致的缺氧微環境可激活 NF-κB/HIF-1α/VEGF 信號通路：一方面通過上調VEGF分泌誘導病理性血管新生，形成結構紊亂的血管網絡，加劇微環境缺氧和酸中毒[13-14];另一方面通過HIF-1α介導的MMPs分泌促進細胞外基質降解（包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白等），既幫助腫瘤細胞突破基底膜屏障實現局部侵襲，又為其遷移開辟物理通道[15-16]。當細胞進人循環系統后，MMPs進一步協助其完成跨內皮遷移和轉移灶微環境重塑，最終形成完整的\"缺氧-血管新生-基質降解\"惡性循環[7]

圖3各組細胞線粒體膜電位的熒光顯微圖（ ×200 ）

圖4各組細胞中有氧糖酵解關鍵酶表達的電泳圖

I：對照組；Ⅱ：丹皮酚低劑量組；ⅡI：丹皮酚中劑量組； IV ：丹皮酚高劑量組。

本研究結果顯示，丹皮酚干預后，T24細胞的劃痕愈合能力顯著降低。為此，筆者進一步測定丹皮酚干預后T24細胞中1 VF-κB/HIF-1α 信號通路以及遷移相關蛋白的表達情況。結果顯示，丹皮酚可下調T24細胞中NF-KB、HIF- ?1α 、VEGF、MMP2、MMP9蛋白表達水平。這表明丹皮酚抑制細胞遷移可能與抑制NF-kB/HIF-1α信號通路活性有關。

Warburg效應關鍵酶（GLUT1、HK2、PKM2）表達升高所導致的代謝重編程是腫瘤細胞的特征之一，Warburg效應通過滿足腫瘤細胞對抗氧化劑和合成代謝物的巨大需求來促進腫瘤細胞的增殖及侵襲[18]。為了進一步探討丹皮酚抑制T24細胞遷移的機制，筆者檢測T24細胞的線粒體功能、ATP濃度、乳酸含量以及有氧糖酵解關鍵酶GLUT1、HK2、PKM2的表達情況。結果顯示，丹皮酚可降低細胞的線粒體膜電位，減少細胞ATP濃度、乳酸含量，下調細胞中GLUT1、HK2、PKM2表達水平，這表明丹皮酚抑制了腫瘤細胞的有氧糖酵解，導致細胞能量供應不足以支持快速增殖和遷移。

綜上所述，丹皮酚可抑制膀胱癌T24細胞的遷移，其作用機制可能與抑制NF-kB/HIF-1α信號通路、下調有氧糖酵解關鍵酶活性有關。

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