芍藥甘草湯調控ASIC3/ERK信號通路改善慢傳輸型便秘大鼠腸道動力的機制研究

中圖分類號R965 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1852-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.06

Study on the mechanism of Shaoyao gancao decoction in improving intestinal motility in rats with slow transit constipation by regulating the ASIC3/ERK signaling pathway

ZHANG Ziqi12，ZHOU Hongyun1，ZHAO Qiong1，2，DENG Yuan3，ZHAO Mengjiel，ZHAO Chen4，CHEN Jingyi1， 2 （1.Dept.of Pediatrics，Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075， China;2.Clinical Medical College，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 6137， China；3.Chongqing College of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 402760，China；4.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToexplore the mechanismof Shaoyao gancao decoction inimproving intestinal motilityinrats with slowtransitconstipation（STC）byregulatingacid-sensitiveionchannel3（ASIC3）/extracelularsignal-regulatedkinase（ERK） signaling pathway.METHODS SDratswereused toconstruct anSTC model bygavage withcompound diphenoxylate.The successfully modeled rats were randomly divided into model group， Shaoyao gancao decoction group （1.5g/mL ），lactulose group 0 208.4mg/mL ，positive control），and combined inhibition group（Shaoyao gancao decoction 1.5g/mL⁺ amiloride hydrochloride 20 （204號 μg/kg） ，with12rats ineachgroup.Additionaly，12healthyrats wereselectedastheblank group.They weregivenrelevant medicinonceadayandcontiuouslyintervenedfor14days.Afterintervention，theintestinalpropulsionfunctionandvisceral sensitvityofthemodelratswere detected.TheexpressionofASIC3inthecolontissueofratswasobservedby

immunohistochemical staining.mRNA expressions of ASIC3， ERK1 and ERK2 as well as protein expressions of ASIC3， ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） in colon tissueof ratswere detected；the ultrastructural changes of the entericnervoussystem（ENS）-interstitial cell of Cajal （ICC）-smooth muscle cell（SMC）network in the rat colon

wereobservedunderelectronmicroscopy.RESULTS Comparedwiththe model group，the intestinalpropulsionrateof the Shaoyao gancaodcoctiongroup wassignificantlyincreased，whilethevisceralpainthresholdwassignificantlydecreasedTheproportioof thepositiveareaofASIC3 inthecolonic tisse wassignificantlyincreased.Therelative mRNA expressionlevelsofERK1，ERK2， and ASIC3，as wellastherelative protein expresionlevelsof p-ERK1/2andASIC3，andthep-ERK1/2 toERK1/2inthecolonic tissue，were all significantly increased （ ΔPlt;0.05 or Plt;0.01 ）.Additionally，there was marked repair of the morphological structure of ICCandSMC，with closer gap junctions observed.Compared with the Shaoyao gancao decoction group，the combined inhibitiongroupexhibitedadiminishedimprovementinintestinalmotilityofrats，withstatisticallysignificantdierenes nthe levels of some indicators（ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）；the repairing of the morphological structure of ICC and SMC was notably atenuated.CONCLUSIONSShaoyaogancaodecoctioncaneffectively improve the intestinal transmission functionandpromote intestinalrepair in STCrats，anditsmechanismmayberelatedtoregulatingthebalanceoftheENS-ICC-SMCnetwork mediated bythe ASIC3/ERK signaling pathway，thus promoting intestinal motility and reducing visceral sensitivity.

KEYWORDSslow transit constipation； Shaoyao gancao decoction； ASIC3； ERK; ENS-ICC-SMC network

功能性便秘是 1～4 歲中國兒童最常見的功能性胃腸病。慢傳輸型便秘（slowtransitconstipation，STC）是兒童功能性便秘的主要類型，主要表現為結腸蠕動減弱或消失、結腸排空延遲。STC在全球兒童中的患病率為13%～25% ，且近年患病率仍在升高，其病程較長且癥狀易反復，嚴重影響患兒身心健康和生活質量]。現代醫學治療STC的手段相對單一，缺乏可靠且作用持久的治療方法。中醫藥治療STC具有安全有效、復發率低、作用持久等優勢[3]

芍藥甘草湯首載于《傷寒雜病論》，該方以養陰增液、潤腸通便為治療之法。成都中醫藥大學附屬醫院兒科趙瓊教授長期在臨床實踐中以酸甘化陰為指導，以生白芍、生甘草為基礎方，在小兒各型便秘，尤其是腸燥津虧型患兒中取得了滿意療效4。本課題組前期臨床研究表明，以芍藥甘草湯為基礎的組方可明顯增加腸燥津虧型便秘患兒的排便頻率，改善糞便性狀，縮短排便時間，遠期隨訪療效相對穩定，復發率低4，且芍藥-甘草3：1配比療效最佳；同時前期實驗研究提示，酸敏感離子通道3（acid-sensingionchannel3，ASIC3）在腸道也有表達，且可能通過影響腸神經調節系統（entericnervoussystem，ENS），從而促進腸道平滑肌運動，改善腸道動力，其可能在芍藥甘草湯治療STC中發揮重要作用，這也與芍藥甘草湯酸甘化陰的立方理論不謀而合。然而，芍藥甘草湯治療STC的作用機制尚未明確，故本研究擬采用復方地芬諾酯溶液灌胃構建STC大鼠模型，探索芍藥甘草湯治療STC的潛在機制，以期為中醫藥治療STC提供新參考。

1材料

1.1主要儀器

JEM-1400型透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社；Pannoramic250型數字切片掃描儀購自匈牙利3DHISTECH公司;SpectraMAXPlus384型酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；D3024R型離心機購自大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；HH系列-6型恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；SD100型核酸定量儀、BT96G型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）基因擴增儀均購自德國AnalytikJena公司。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥甘草湯由生白芍、生甘草組成，這2種飲片購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司（批號分別為D2209079、2206076），經成都中醫藥大學藥學院黃勤挽教授鑒定合格，分別為芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根和甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根。

復方地芬諾酯片（批號220501，每片含鹽酸地芬諾酯 2.5mg 、硫酸阿托品 25μg 購自廣西河豐藥業有限責任公司;乳果糖口服溶液[批號366197，規格 （以乳果糖計）]購自荷蘭Abbott公司;鹽酸阿米洛利（貨號HY-B0285A，規格 100mg/ 瓶）購自美國MCE公司；活性炭、阿拉伯膠（批號分別為C14358027、C14362403）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；電鏡固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司；兔單克隆ASIC3抗體（批號ab302776）購自英國Abcam公司；兔單克隆胞外信號調節激酶1/2（extracellularsignal-regulatedkinases1/2，ERK1/2）抗體（批號T40071）、兔單克隆磷酸化ERK1/2（phosphorylatedERK1/2，p-ERK1/2）抗體（批號TA1015）均購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（批號GB23303）兔抗 β -肌動蛋白（ -actin）（批號GB11001）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；HRP標記的（鼠+兔）二抗（批號BA1056）購自美國BOSTER公司。

1.3實驗動物

本研究所用動物為4周齡SPF級SD大鼠，共60只，體重 （70±10）g ，雌雄各半，購自北京斯貝福有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。實驗動物飼養于成都中醫藥大學溫江校區藥理學實驗室動物飼養中心。大鼠飼養在相對濕度 （55±10）% 、相對溫度 （25±2）^°C，12h/12h 明暗交替、每小時 10～15 次通風換氣的環境中，以普通顆粒飼料喂養，飲用水為純凈水。所有實驗程序均經四川省實驗動物學會倫理委員會批準（批準號為P202303201）。

2 方法

2.1 藥液和墨汁的制備

（1）芍藥甘草湯：根據本課題組前期臨床研究，稱取生白芍 18g 生甘草 6g ，第一次煎煮前先將飲片用8倍體積RO純水浸泡 30min ，加熱回流收集藥液，第二次以6倍體積RO純水加熱回流再次收集藥液。合并2次藥液，冷卻后，用200目篩過濾，取濾液。濾液減壓濃縮成質量濃度為 1.5g/mL 的濃縮液（以生藥量計），于 4^°C 冰箱保存備用，使用前恢復至室溫。（2）復方地芬諾酯溶液：將復方地芬諾酯片研磨成細粉，用生理鹽水配制成質量濃度為 1.5mg/mL 的混懸液，即配即用。3）墨汁：將阿拉伯膠 50g 與水 400mL 混合，煮沸至澄清透明，再加活性炭 25g ，混勻并煮沸3次，冷卻，用水定容至 500mL 4^°C 下保存，使用前放至常溫并攪拌搖勻。（4）乳果糖溶液：取乳果糖口服液適量，用生理鹽水制成質量濃度為208.4mg/mL 的溶液，即配即用。（5）ASIC3抑制劑：取ASIC3抑制劑鹽酸阿米洛利適量，以生理鹽水配制成質量濃度為 2μg/mL 的阿米洛利溶液，避光，即配即用。

2.2 分組、造模與給藥

大鼠適應性喂養1周后，按體重隨機分為空白組（12只）和造模組（48只），雌雄各半。造模組大鼠參考相關文獻[6-]，采用復方地芬諾酯溶液灌胃 15mg/（kg?d） ，每天1次，連續14d構建STC模型，空白組大鼠灌胃等體積生理鹽水。造模后，若造模組大鼠出現體形干癟瘦小、毛發豎立、拱背、活動減少、糞便質量減輕、糞便顆粒變細硬，大便Bristol評分較空白組顯著變化，且首粒黑便排出時間較空白組顯著延長，則視為STC模型復制成功。造模后，大鼠全部存活。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、芍藥甘草湯組、乳果糖組（陽性對照）聯合抑制組，雌雄各半，每組12只。給藥劑量以兒童臨床用藥劑量為基礎，按人與大鼠等效劑量換算，給藥劑量參考課題組前期實驗用量。芍藥甘草湯組、聯合抑制組大鼠灌胃芍藥甘草湯濃縮液（ 1.5g/mL ，乳果糖組大鼠灌胃乳果糖溶液（ 208.4mg/mL ），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;所有藥物均按大鼠體重以 0.01mL/g 灌胃。此外，聯合抑制組大鼠以配制好的阿米洛利溶液0 20μg/kg 腹腔注射，其他各組大鼠同步腹腔注射等體積生理鹽水。灌胃和腹腔注射均為每日1次，連續干預14d 。

2.3 腸道傳輸功能檢測

造模結束后大鼠立即禁食 24h ，然后以墨汁灌胃0 Δ?10mL/kg^′ ，記錄從灌胃結束到排出首粒帶活性炭糞便所需的時間，即為首粒黑便排出時間。上述指標檢測后，采用隨機數字表法每組選取4只大鼠禁食、不禁水24h ，以墨汁灌胃 （10mL/kg），30min 后予以戊巴比妥鈉1 30mg/kg） 腹腔注射麻醉，頸椎脫白處死，隨后立即置于手術臺上解剖，快速取出其全部腸道，在無張力的狀態下測量大鼠的腸道全長及墨汁在腸道內推進的長度，并計算腸道推進率。腸道推進率 （%）= 黑染腸道長度/腸道全長 ×100%^[6] 。

2.4 內臟敏感性檢測

使用自制的壓力球囊及自制的透明鼠籠進行檢測。干預結束后，“2.3\"項下部分大鼠（ n=6 禁食 12h 后使用乙醚麻醉，將壓力球囊放入大鼠肛門內約 5cm 處后固定，再將大鼠放人透明鼠籠。待大鼠蘇醒及適應環境后，加壓球囊，分別在 20?40?60?80mmHg（1mmHg=） 133.322Pa 壓力下保持30s進行腹壁撤退反射（abdomi-nalwithdrawalreflex，AWR）評分。AWR評分為0分：大鼠無明顯變化；1分：大鼠情緒不穩定，身體靜正不動，頭部偶爾扭動或上下運動；2分：大鼠腹肌輕微回縮，但未離開鼠籠底面；3分：大鼠腹肌較強烈收縮，部分抬離鼠籠底面；4分：大鼠腹肌強烈收縮，腹部呈弓形，完全抬離鼠籠底面，骨盆抬起。記錄內臟痛閾值（AWR評分 ?=3 時所對應的壓力值）以反映內臟敏感性，重復檢測3次，每次間隔 10min 。

2.5大鼠結腸組織中ASIC3的表達及分布觀察

采用免疫組化染色觀察。“2.4”項下實驗結束后，取各組大鼠（ n=6 部分結腸組織（剩余部分置于 -80^°C 保存備用）用 4% 多聚甲醛固定，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、蒸餾水清洗、石蠟包埋、脫蠟并水化后，進行切片；抗原修復切片，加入ASIC3抗體（稀釋比例為1：100）4^°C 孵育過夜，以PBS洗滌，滴加HRP標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1：100）孵育，再以PBS洗滌。將洗滌好的切片用DAB顯色，經蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，以中性樹膠封片。選取3個不同視野在顯微鏡下觀察，用數字掃描瀏覽軟件CaseViewer采集顯微圖像，用數據分析系統計算圖像中ASIC3陽性（呈棕黃色）面積占比以反映ASIC3蛋白表達。

2.6大鼠結腸組織中ASIC3、ERK1、ERK2mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR檢測。取“2.5”項下部分于一 80^°C 保存的大鼠結腸組織 ，使用低溫研磨儀研磨，加人Trizol試劑提取結腸組織總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA。在cDNA（ 2μL ，以DEPC水稀釋至10ng/μL 中加入 0.2μmol/L 基因上下游引物、 10μL 的SYBRGreen試劑 ，7.8μL 的DEPC水，混勻后離心，再進行PCR反應。具體程序為 95^°C，5min;94^°C，10s;60～ 66^°C，30s ；循環40次。以 β -actin為內參，采用公式2^-ΔΔCt 計算各目標基因mRNA的相對表達量。引物序列及產物長度見表1。

表1PCR引物序列及產物長度

2.7大鼠結腸組織中ASIC3、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.5”項下部分于-80^°C 保存的大鼠結腸組織（ n=6 ，加入RIPA裂解液浸沒組織并于低溫組織研磨儀中研磨。收集離心后的組織勻漿上清液，采用BCA法調整蛋白濃度 （2～3μg/μL） ！將蛋白變性后，進行凝膠恒壓電泳、轉膜。洗去膜上殘留轉膜液，以 5%BSA 封閉1h，加人ASIC3、ERK1/2、p-ERK1/2一抗（稀釋比例均為1：1000）和 β -actin抗體（稀釋比例為 1：5 000 孵育過夜；TBST漂洗膜上未結合的一抗，加入相應二抗（稀釋比例為 1：2 000 ），室溫孵育 ；TBST洗膜，滴加ECL顯影液于暗室中曝光顯影，采集蛋白條帶圖像。采用ImageJ軟件分析，以目標蛋白與內參蛋白（ β -actin）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.8結腸ENS-Cajal間質細胞-平滑肌細胞網絡超微結構觀察

取“2.5”項下部分于 -80^°C 保存的大鼠結腸組織1 n=6 ），置于 2.5% 戊二醛固定液中固定過夜，以PBS漂洗；用 1% 四氧化 20^°C 固定 2h ，再以PBS漂洗樣本，完成后以梯度乙醇-丙酮脫水；脫水后包埋，于 37^°C 烘箱中過夜，再于 60^°C. 烘箱中聚合 48h 。樣本包埋塊以超薄切片機切片（ 60～90nm ，展開后撈至銅網，在室溫下先后以醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，室溫干燥過夜。采用透射電鏡觀察大鼠結腸組織超微結構并采集圖像。每張銅網先于6000倍下觀察目標區域整體結構情況，再分別采集目標區域下Cajal間質細胞（interstitialcellofCajal，ICC）（6000倍和30000倍）平滑肌細胞（smoothmusclecell，SMC）（6000倍和30000倍）、縫隙連接結構（8000倍和40000倍）圖像。

2.9 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計分析，計量資料滿足正態分布以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;計量資料不符合正態分布以 M（P_²⁵，P_⁷⁵） 表示，多組間比較采用非參數Kruskal-Wallis H 檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以例數或率 （%） 表示，采用 χ² 檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3結果

3.1芍藥甘草湯對大鼠腸道傳輸功能的影響

與空白組比較，造模組大鼠排出首粒黑便時間顯著延長[ （124.25±89.58）min Vs. （387.92±103.68）min，Plt; 0.01]，提示STC大鼠模型構建成功。

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯合抑制組大鼠腸道推進率分別為（ 80.22±8.30）% 、 63.86± 7.76）% 、 （65.64±9.72）% 、 76.29±10.03）% 、 （67.00± 9.28）% 。與空白組比較，模型組大鼠腸道推進率顯著降低（ Plt;0.01 ；與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠腸道推進率顯著升高 （Plt;0.01 ）。

3.2芍藥甘草湯對大鼠內臟敏感性的影響

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯合抑制組大鼠內臟痛閾值分別為 （70.00±9.19 、 85.00±17.86） 一（ 67.78±5.44 、 48.33±5.05 ）、 68.89±9.11）mmHg 。與空白組比較，模型組大鼠內臟痛閾值顯著升高 Plt; 0.05）；與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠內臟痛閾值均顯著降低 Plt;0.01 ）;與芍藥甘草湯組比較，聯合抑制組大鼠內臟痛閾值顯著升高（ 1lt;0.05 ）。

3.3芍藥甘草湯對大鼠結腸組織中ASIC3蛋白表達的影響

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯合抑制組大鼠ASIC3陽性面積占比分別為 （20.41±5.91）% ！（6.71±4.82）H_o.（9.00±2.30）H_o.（16.23±5.10）H_o.（8.51± 4.27）% 。大鼠結腸組織中的ASIC3陽性表達呈棕黃色，主要表達在黏膜下層及肌層。與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中ASIC3蛋白表達水平顯著降低（ Plt; 0.05）；與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠結腸組織中ASIC3蛋白表達水平顯著升高 （Plt;0.01 ；與芍藥甘草湯組比較，聯合抑制組大鼠結腸組織中ASIC3蛋白表達水平顯著降低（ Plt;0.01 ）。結果見圖1。

3.4芍藥甘草湯對大鼠結腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對表達量均顯著降低 （Plt;0.05 或 Plt;0.01 ；與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠結腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對表達量均顯著升高（ Plt;0.05） ；與芍藥甘草湯組比較，聯合抑制組大鼠結腸組織中ERK2、ASIC3mRNA相對表達量均顯著降低（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），ERK1mRNA相對表達量有下降趨勢，但差異無統計學意義 ?Pgt;0.05 。結果見表2。

圖1各組大鼠結腸組織中ASIC3蛋白表達的免疫組化圖 ×400 ）

紅色箭頭：ASIC3陽性染色。

表2各組大鼠結腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對表達量比較

a：與空白組比較， Plt;0.05：6 與空白組比較， Plt;0.01 ;c：與模型組 比較， Plt;0.05 ;d：與芍藥甘草湯組比較， Plt;0.01 ；e：與芍藥甘草湯組比 較， ΔPlt;0.05Δ □

3.5芍藥甘草湯對大鼠結腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2及ASIC3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對表達量以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均顯著降低（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）;與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠結腸組織中p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對表達量以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均顯著升高 （Plt;0.01） ;與芍藥甘草湯組比較，聯合抑制組大鼠結腸組織中ASIC3蛋白相對表達量以及 p -ERK1/2與ERK1/2比值均顯著降低（ ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結果見表3及圖2。

3.6芍藥甘草湯對大鼠結腸ENS-ICC-SMC網絡超微結構的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸ICC和平滑肌纖維形態結構嚴重受損：ICC呈梭形，ICC細胞核呈不規則形，可見核固縮現象，SMC細胞核呈不規則形，兩者均可

表3各組大鼠結腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對表達量比較 ）

a：與空白組比較， Plt;0.01 ；b：與空白組比較， Plt;0.05：c; 與模型組比較， Plt;0.01 ;d：與芍藥甘草湯組比較， Plt;0.01 ;e：與芍藥甘草湯組比較 ?Plt;0.05， 0

圖2各組大鼠結腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2、ASIC3蛋白表達的電泳圖

I：空白組；ⅡI：模型組；II：乳果糖組； IV ：芍藥甘草湯組；V：聯合抑制組。

見線粒體明顯腫脹，基質溶解，線粒體嵴溶解，呈明顯空泡化樣變性；細胞間縫隙明顯增寬（空白組細胞間隙約為 0.05μm ，模型組細胞間隙約為 0.15μm ）。與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠結腸ICC和平滑肌纖維形態結構明顯修復：ICC呈梭形，ICC細胞核呈橢圓形，SMC細胞核呈鋸齒狀，兩者細胞核染色質均勻，線粒體輕度腫脹，基質部分溶解，僅有少許空泡化樣變性；細胞間縫隙連接較為緊密（芍藥甘草湯組細胞間隙約為 0.07μm ）。與芍藥甘草湯組比較，聯合抑制組大鼠結腸ICC和平滑肌纖維形態結構的修復作用明顯減弱：ICC呈星形，ICC細胞核皺縮，線粒體嵴溶解斷裂，基質顆粒減少，內質網輕度或明顯擴張，細胞膜不連續，SMC細胞核呈紡錘形，ICC細胞核呈類圓形，染色質分布較均勻，核膜連續完整，細胞內線粒體腫脹較明顯，嵴結構減少，基質稀淡，兩者線粒體均腫脹；細胞間縫隙連接較模型組更緊密而較芍藥甘草湯組稍松散（聯合抑制組細胞間隙約為0.10μm ）。結果見圖3。

4討論

STC是一類以結腸傳輸減慢為特點的頑固性便秘，其病理機制十分復雜，現代研究認為與腸神經系統、水液代謝、腸道動力及腸道菌群等密切相關-2]。研究表明，中醫藥治療小兒STC療效明確，安全可靠，遠期療效相對良好[3]。芍藥甘草湯是酸甘化陰的代表方劑，該方首載于《傷寒雜病論》，原方由白芍和甘草各4兩組成，后世醫家則提到該方臨床治療便秘療效顯著，適用于腸燥津虧便秘。《名醫別錄》指出白芍有通順血脈、利膀胱大小腸之效，《本經疏證》也記載：“芍藥能入脾開結，芍藥合甘草以破腸胃之結。\"趙瓊教授恪守《素問·至真要大論》中“燥者濡之”的治療原則，結合長期臨床經驗，提出以“酸甘化陰”為指導，酸甘相配、養陰增液、潤腸通便，以芍藥甘草湯為基礎，在臨床上取得了良好的療效。本課題組前期臨床研究表明，以該方為基礎治療小兒STC效果顯著，同時也對本方重要的單體成分芍藥昔改善STC癥狀的效應進行了相關研究，證實了其有效性[4]。

注：圖中ICC的放大倍數為 ×30000 ;SMC的放大倍數為 ×8000 ；縫隙連接結構的放大倍數為 ×40000. 0

圖3各組大鼠結腸組織ENS-ICC-SMC網絡超微結構圖

ENS、ICC、SMC共同組成ENS-ICC-SMC網絡，其被認為是腸道動力的基本單位，是完成排便功能的關鍵；ICC與腸神經末梢呈突觸樣連接，與SMC呈縫隙連接，形成ENS-ICC-SMC網絡結構；ENS與中樞神經系統、自主神經系統共同調節胃腸道功能，同時，ENS具有完整的反射結構，通過消化道神經叢中的感覺、運動及中間神經元調控腸內感受、平滑肌運動及消化道內外分泌等[9-10]。ICC是介于ENS和SMC之間的非神經間質細胞，在腸道內廣泛分布，傳導慢波運動，將信號傳遞至SMC以此調控平滑肌運動。腸道平滑肌是腸道運動的效應器，呈內環外縱的雙層結構，是腸道收縮和舒張功能正常的基礎，也是維持腸道完整性的重要組成部分。ENS與ICC之間及ICC與SMC之間分別通過突觸連接和縫隙連接互相傳遞信息，構成了腸道運動的基礎單位。研究表明，便秘模型動物中ENS-ICC-SMC網絡結構和功能的穩定平衡是維系腸道動力正常的關鍵[]。STC患者及模型動物中ICC多表現為數量減少或消失、體積縮小、分布不規則、超微結構損傷[12]。SMC在STC患者和模型動物中也被發現存在明顯異常，包括收縮力減弱、張力下降、厚度變薄、數量減少、形態異常、結構破壞等[3]。Zhu等研究表明，芍藥甘草湯通過增加SMC和ICC數量，抑制ICC凋亡，激活干細胞因子/干細胞因子受體信號通路，從而保護ENS-ICC-SMC網絡。總之，芍藥甘草湯通過影響ENS-ICC-SMC網絡在STC的治療中起到重要作用，但其作用機制仍缺乏相對系統的研究。

ASICs是一類非電壓依賴性離子通道，其中ASIC3是ASICs家族在結腸中表達最多的亞型。已有研究提示，ASIC3可被酸性環境激活，介導酸感知和機械感知，對情緒、痛覺、酸味覺等具有重要作用，參與調節胃腸動力、疼痛感知、血壓等[14-15]。研究證實，ASIC3在胃腸道黏膜也有表達，且可通過影響ENS從而促進腸道平滑肌運動，改善腸道動力[。有研究報道，移植了便秘患兒糞便菌液的大鼠腸道組織中ASIC3表達顯著下調，內臟敏感性降低，腸道推進率下降，結腸傳輸時間延長。Yuan等研究報道，ASIC3抑制劑能調節腸易激綜合征小鼠的腸道蠕動并降低其內臟敏感性。有研究報道，芍藥甘草湯或其主要成分可通過干預ASICs發揮鎮痛及修復損傷的作用，其中ERK信號通路可能是其干預的關鍵通路[19-20]。有研究顯示，在野生型小鼠的滑膜細胞中，酸性和炎癥條件均能激活ASIC3；單獨酸性條件下，p-ERK減少；酸性和炎癥條件共存時，p-ERK增加，抑制細胞增殖211，故ASIC3在不同條件下調控p-ERK的效果不同。另有研究表明，缺氧和ASIC3過表達可通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路影響髓核細胞[20]。由此推測，芍藥甘草湯可能通過調控腸道ASIC3/ERK信號通路作用于ENS-ICC-SMC網絡，介導STC大鼠腸道動力及內臟敏感性，從而治療STC。

本研究結果顯示，經芍藥甘草湯干預后，STC大鼠腸道推進率顯著升高，內臟敏感性顯著降低；實時熒光定量PCR、Westernblot檢測結果顯示，芍藥甘草湯的干預能顯著上調STC大鼠結腸組織中ERK1/2表達，促進ASIC3、ERK1、ERK2mRNA和蛋白表達；透射電鏡觀察結果發現，模型組大鼠結腸ENS-ICC-SMC網絡超微結構損傷嚴重：ICC呈梭形，細胞核不規則且可見核固縮，SMC細胞核也不規則，兩者線粒體明顯腫脹和空泡化，細胞間縫隙增寬，而經芍藥甘草湯干預后，以上損傷可見明顯修復。ASIC3抑制劑的引人明顯抑制了芍藥甘草湯對STC大鼠以上機制的調控作用，表明芍藥甘草湯通過調控ASIC3信號通路改善了模型大鼠的便秘情況。

綜上所述，芍藥甘草湯可能通過調控ASIC3/ERK信號通路介導ENS-ICC-SMC網絡來改善STC大鼠腸道動力，降低內臟敏感性，進而發揮酸甘化陰、增液通便的效應，其中ASIC3可能是芍藥甘草湯發揮治療作用的關鍵因子。

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