檳榔抗（耐）黃葉病毒病種質(zhì)資源調(diào)查與鑒定評價(jià)

摘" 要：檳榔黃葉病毒病是由檳榔長線型病毒1（Areca palm velarivirus 1，APV1）引起的一種致死性病害，目前尚無有效的防控措施。培育抗（耐）病品種是解決檳榔病理黃化的關(guān)鍵途徑，而收集優(yōu)異資源材料則是育種工作的重要物質(zhì)來源。本研究以海南檳榔病理黃化三大重災(zāi)區(qū)（屯昌、瓊海、萬寧）為調(diào)查區(qū)域，系統(tǒng)開展資源收集、表型觀測、病原檢測及持續(xù)跟蹤等研究。研究結(jié)果表明，在收集的200份檳榔資源材料中，100份抗（耐）病資源中有84份未檢測出APV1，而100份感病資源中有92份檢測出APV1，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)APV1與植株病理黃化表型之間存在密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)表明所篩選的抗（耐）病資源具有代表性。通過持續(xù)跟蹤觀察與關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)檳榔樹齡與抗（耐）病之間呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究成功篩選出一批具有抗（耐）病特性的檳榔種質(zhì)資源，為后續(xù)抗病品種的培育奠定重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：檳榔；黃葉病毒??；種質(zhì)資源；鑒定評價(jià)中圖分類號：S324 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Investigation and Evaluation of Arecanut Germplasm Resources for Resistant to Leaf Yellowing Virus Disease

HUANG Liyun， LIU Fan， ZHOU Huanqi， ZHU Hui， PENG Chunlin， LIU Liyun

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropic Agricultural Sciences / Hainan Engineering Research Center of Arecanut Industry， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract： Areca palm leaf yellowing virus disease， caused by"Areca palm velarivirus 1（APV1）， is a fatal disease for which no effective control measures currently exist. Breeding resistant or tolerant varieties is the key approach to addressing this issue， while the collection of superior germplasm resources is an essential foundation for breeding efforts. This study focused on three major affected areas in Hainan Province （Tunchang， Qionghai， and Wanning） and systematically conducted research activities including germplasm collection， phenotypic observation， pathogen detection， and long-term monitoring. The results revealed that among the 200 areca palm germplasm materials collected， 84 out of 100 resistant/susceptible materials did not show the presence of APV1， while 92 out of 100 susceptible materials tested positive for APV1. This finding confirmed a close association between APV1 infection and plant yellowing symptoms， and demonstrated that the screened resistant/tolerant materials are representative. Through continuous observation and correlation analysis， a significant negative correlation was found between tree age and resistance/tolerance to the disease. This study successfully identified a group of betel palm germplasm resources with resistance/tolerance traits， laying a crucial foundation for the development of disease-resistant varieties in future breeding programs.

Keywords： Areca catechu L.; areca palm leaf yellowing virus disease; germplasm resources; evaluation and identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.007

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科（Palmae）檳榔屬（Areca）多年生喬木，作為海南省產(chǎn)值最高的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，在地方經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。據(jù)《海南省統(tǒng)計(jì)年鑒（2023）》統(tǒng)計(jì)，海南檳榔種植面積達(dá)18.4萬hm²，占熱帶作物總種植面積的27.98%，其產(chǎn)值貢獻(xiàn)率超過80%，是具有單位面積產(chǎn)值最高（22.5～75.0萬元/hm²）、解決脫貧人口最多（產(chǎn)業(yè)脫貧23萬人，占總貧困人口的38.3%）的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。隨著檳榔消費(fèi)市場與種植面積的迅速擴(kuò)張，檳榔病理黃化危害備受關(guān)注，檳榔病理黃化現(xiàn)象于1981年首次出現(xiàn)在海南省屯昌縣^[1]，經(jīng)過40余年的發(fā)展，該病害已擴(kuò)散至全島檳榔園，發(fā)生危害面積為3.83萬hm²，占總種植面積的33.27%以上^[2]，給檳榔產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性的打擊。2001年，羅大全等^[3]、車海彥等^[4]、周亞奎等^[5]鑒定出檳榔黃化病由植原體（areca palm yellow leaf phytoplasam，AYLP）引起，2015年，YU等^[6]、于紅美^[7]采集表現(xiàn)黃化病癥的葉片中分離出長線型病毒（Areca palm velarivirus 1，APV1），推測APV1與黃葉病有密切的關(guān)系，并報(bào)道了APV1全長基因組。2020年，王洪星^[8]利用RNA-seq和數(shù)字表達(dá)譜（DEG）技術(shù)對采集的黃化樣品進(jìn)行分析，其中6個(gè)DEGs注釋為APV1基因。自此，檳榔病理學(xué)界認(rèn)為檳榔黃化是植原體與APV1單一侵染或復(fù)合侵染所致^[9-10]，2種病原引發(fā)的癥狀及其相似，典型特征為黃化部分與正常綠色組織有明顯的界限，感病后不可逆轉(zhuǎn)，一般5～7"a植株死亡。多年來該問題一直未能找到有效的防控措施。

歷史上嚴(yán)重病害造成的危害，大都通過抗病品種的培育與推廣得以解決。培育抗（耐）病品種是解決檳榔病理黃化問題的重要途徑，而優(yōu)異資源材料的獲得是培育品種最為關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)。海南40余年來的檳榔病害蔓延淘汰了大片檳榔園，同時(shí)也留下了較為豐富的抗（耐）黃化種質(zhì)資源。本研究以屯昌、萬寧、瓊海為資源調(diào)查點(diǎn)，以危害程度最高等級的黃化園（全園發(fā)病率70%以上）為選擇標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查收集樣品材料，通過植株表型與檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)分析，持續(xù)跟蹤、觀察、檢測，鑒定評價(jià)并篩選出一批檳榔抗（耐）病種質(zhì)資源，為抗（耐）病品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1" 材料

1.1.1 "材料來源地" 資源調(diào)查收集點(diǎn)選擇在海南檳榔病理黃化發(fā)生早，危害面積大的3個(gè)傳統(tǒng)檳榔種植市縣（萬寧、瓊海、屯昌）進(jìn)行，其中有海南檳榔病理黃化首次發(fā)現(xiàn)且黃化發(fā)生面積第4的屯昌縣，海南省檳榔種植面積第4且黃化發(fā)生面積第1的萬寧市，以及海南省檳榔種植面積第1且黃化發(fā)生面積第2的瓊海市^[2]。取樣園按照中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)布的“檳榔黃化病防控明白紙”規(guī)定的檳榔園危害程度分級，以最高危害等級病理黃化園為選擇標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查。

1.1.2 "試劑與儀器 "主要試劑：RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR mix均購于天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器：Bio-Rad T100 PCR 儀器，凝膠電泳儀，高速低溫組織研磨儀（KZ-III-F）。

1.2" 方法

1.2.1" 樣品采集" 采用地毯式搜索方法搜查屯昌縣南呂鎮(zhèn)、坡心鎮(zhèn)、烏坡鎮(zhèn)，瓊海市萬泉鎮(zhèn)、龍江鎮(zhèn)、嘉積鎮(zhèn)，萬寧市長豐鎮(zhèn)、三更羅鎮(zhèn)、南橋鎮(zhèn)、興隆鎮(zhèn)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)的檳榔病理黃化重病園，對長勢良好、植株全綠、結(jié)果正常的檳榔植株及鄰靠的嚴(yán)重黃化植株（黃化葉片面積占整個(gè)樹冠葉面積的 80%以上，部分檳榔樹冠縮小50%以上，呈重度束頂狀）進(jìn)行采樣，采樣部位為從下往上數(shù)至樹冠中部第3～4片葉。記錄樣本采集點(diǎn)的地形和土壤類型情況，采集點(diǎn)地形分別為：水田、平地、坡地，土壤類型分別為：沙土、沙壤土、壤土、粘土及其他。

1.2.2" 樣品處理" 勾刀取下檳榔小裂片葉后快速放入編號的樣品袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。剪取檳榔葉片50 mg放入標(biāo)記的無菌無酶研磨管中，加入直徑4 mm的無酶無菌鋼珠3粒，按順序置于研磨鋼槽中，迅速置于超低溫冰箱冷凍，備用。

1.2.3" 檳榔RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA合成" 參照RNApre Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒說明書方法提取樣品總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在–20"℃條件下保存，備用。

1.2.4" APV1病原檢測" 以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，使用特異性病毒引物對YLDV-2F（GATCTGTGAATATATCAGAACA）與YLDV-2R（CACCCTTGGTATCAACAATAGA）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增^[8]。反應(yīng)擴(kuò)增體系：cDNA模板2.0"μL、Taq PCR mix預(yù)混液17.0 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95"℃預(yù)變性4 min；95"℃變性30"s；55"℃退火溫度設(shè)定30 s；72"℃延伸1"min，循環(huán)35次；72"℃終止補(bǔ)償延伸10 min。PCR產(chǎn)物用Gel Stain核酸染料染色，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，隨后拍照保存。

1.2.5" 次年跟蹤觀測 "在2023年調(diào)查的基礎(chǔ)上，2024年進(jìn)行持續(xù)跟蹤觀測，對檳榔植株葉片黃化情況分級（0級：葉片全綠，結(jié)果正常；1級：1片葉出現(xiàn)黃化；3級：2～3片葉出現(xiàn)黃化；5級：4～6片葉出現(xiàn)黃化；7級：整株葉片均黃化）。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用SPASS 19軟件作顯著性和相關(guān)性分析。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "資源調(diào)查結(jié)果

以海南省屯昌、萬寧、瓊海3個(gè)市（縣）含10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)病理性黃化發(fā)生嚴(yán)重的檳榔園（屯昌縣南呂鎮(zhèn)、坡心鎮(zhèn)、烏坡鎮(zhèn)，瓊海市萬泉鎮(zhèn)、龍江鎮(zhèn)、嘉積鎮(zhèn)，萬寧市長豐鎮(zhèn)、三更羅鎮(zhèn)、南橋鎮(zhèn)和興隆鎮(zhèn)）為普查范圍。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，重病檳榔園的檳榔植株幾乎全部受到黃化病原侵害（圖1），80%以上檳榔植株幾近死亡。但部分重病園內(nèi)發(fā)現(xiàn)極少數(shù)生長狀態(tài)良好的檳榔植株，葉片全綠，結(jié)果正常（圖2A）。經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，最終選定3個(gè)市（縣）10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)32個(gè)檳榔園，園區(qū)覆蓋面積為89.97 hm²，共選擇定位抗（耐）病種質(zhì)資源100份。

2.2 "樣品分布及生境信息

2023年6—10月，共采集資源葉片樣品200份[抗（耐）病資源100份，感病資源100份]，其中屯昌76份，萬寧102份，瓊海22份，樣品采樣數(shù)量地區(qū)分布及生境情況見表1、圖3。采樣檳榔園海拔為12.50～162.75 m，地形主要為平地，少部分為坡地，土壤類型主要為沙壤土和壤土，樹齡范圍為7～22 a。

2.3" APV1檢測結(jié)果

采用特異性引物YLDV-2F/YLDV-2R對200份資源材料進(jìn)行APV1病原檢測，抗（耐）病資源中，84份資源顯示為陰性，16份顯示陽性感染，分別為：屯昌-15、屯昌-16、屯昌-18、屯昌-24、屯昌-30、屯昌-31、瓊海-48、瓊海-49、萬寧-58、萬寧-59、萬寧-60、萬寧-61、萬寧-84、萬寧-91、萬寧-92、萬寧-99。另100份感病資源中，92份被檢測為陽性，僅8份未能顯示出陽性感染（表2）。實(shí)驗(yàn)過程中，所有空白對照和陰性對照均未顯示出任何污染或假陽性結(jié)果（圖4）。另外，陽性對照樣品成功擴(kuò)增出預(yù)期的311 bp的特異性片段，進(jìn)一步證實(shí)檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

2.4 "次年跟蹤調(diào)查結(jié)果

對2023年檢測出陽性的資源植株進(jìn)行跟蹤觀察，2024年調(diào)查與檢測發(fā)現(xiàn)，16份資源材料中，9份材料出現(xiàn)不同程度的黃化現(xiàn)象，其余屯昌和萬寧的7份材料尚未出現(xiàn)黃化（表2）。結(jié)合檳榔生境指標(biāo)及樹齡開展與植株黃化程度的相關(guān)性分析（表3），1 a內(nèi)檳榔黃化程度與樹齡呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）。

3 "討論

APV1病毒是檳榔黃化的主要致病病原之一，自YU等^[6]首次報(bào)道APV1在我國發(fā)生以來，其危害性已得到廣泛證實(shí)。WANG等^[10]研究表明APV1與檳榔黃化的發(fā)生與流行密切相關(guān)；牛曉慶等^[11]對海南萬寧地區(qū)黃化病園的調(diào)查顯示，APV1引起的病毒病發(fā)生率高達(dá)75%～100%。林兆威等^[12]對海南等四大檳榔主產(chǎn)區(qū)（萬寧、瓊海、定安、文昌）的系統(tǒng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，APV1陽性率分別為91.95%、86.95%、89.65%、73.68%，表明該病毒在海南檳榔主栽區(qū)具有高流行率，且病害表型與分子檢測結(jié)果呈顯著相關(guān)性。目前，檳榔抗（耐）病種質(zhì)資源匱乏已成為制約抗病育種進(jìn)程的主要瓶頸。因此，開展APV1抗（耐）病種質(zhì)資源的系統(tǒng)篩選、收集與鑒定檳榔APV1相關(guān)抗（耐）病資源，是解決目前檳榔抗病親本缺乏、抗病育種進(jìn)程受限的重要途徑之一。

本研究在檳榔黃化重病園系統(tǒng)定位收集200份抗（耐）及感病資源樣品，采用王洪星^[8]開發(fā)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，在100份抗（耐）病資源中，APV1的陰性樣品占比84%，陽性樣品占比16%。值得關(guān)注的是，16份陽性植株雖攜帶APV1，但未表現(xiàn)黃化癥狀，推測其原因可能為：（1）處于病害侵染初期，尚未表現(xiàn)典型癥狀；（2）植株體內(nèi)存在抗（耐）病基因或免疫機(jī)制，抑制了病毒癥狀的表達(dá)。對100份感病資源的檢測結(jié)果顯示，92份（92%）樣品攜帶APV1，僅8份（8%）未檢測到APV1。經(jīng)分析，未檢出APV1的感病樣品可能由以下因素導(dǎo)致：（1）由于水分或營養(yǎng)不平衡導(dǎo)致的生理性黃化；（2）由其他病原物侵染引發(fā)的相似癥狀。綜合分析表明，本研究所選取的抗（耐）病資源及感病資源對比檢測結(jié)果差異顯著，抗（耐）病優(yōu)異資源具有較好的代表性，有望從中篩選獲得優(yōu)異資源或通過GWAS分析挖掘抗病基因。

基于資源調(diào)查與鑒定分析結(jié)果，本研究提出檳榔抗（耐）黃化種質(zhì)資源收集應(yīng)遵循以下科學(xué)原則。（1）樹齡篩選標(biāo)準(zhǔn)：優(yōu)先選擇樹齡≥15 a的檳榔園作為資源收集地。樹齡較小的植株可能處于病害侵染初期，尚未經(jīng)歷足夠時(shí)間的病原選擇壓力，其抗病表型可能存在不穩(wěn)定性。這一結(jié)論得到本研究的實(shí)證支持：2023年調(diào)查中表現(xiàn)全綠的幼齡植株，在次年即出現(xiàn)黃化癥狀，表明其抗病表型缺乏持久性。（2）植株形態(tài)一致性：應(yīng)選擇株高相對一致的植株作為候選資源。顯著高于群體平均株高的個(gè)體可能因空間異質(zhì)性導(dǎo)致媒介昆蟲的選擇性回避，從而產(chǎn)生“假抗性”表型，影響資源篩選的準(zhǔn)確性。（3）空間分布排除原則：應(yīng)排除園區(qū)邊緣地帶的植株。這些植株受邊緣效應(yīng)影響，其生長環(huán)境與園區(qū)內(nèi)部存在顯著差異，可能降低媒介昆蟲的傳播概率，導(dǎo)致抗病表型評價(jià)出現(xiàn)偏差。上述原則的建立為檳榔抗（耐）病種質(zhì)資源的科學(xué)篩選提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，有助于提高資源收集的準(zhǔn)確性和可靠性。

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