斯里蘭卡木薯花葉病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

摘" 要：由斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）侵染引起的斯里蘭卡木薯花葉病是近年來我國木薯種植中新發(fā)的危險性病害?，F(xiàn)有檢測技術(shù)存在靈敏度低、效率不高等不足，限制了相關(guān)工作的開展。本研究根據(jù)病毒基因序列設(shè)計引物和探針，制備陽性質(zhì)粒標準品，建立SLCMV的TaqMan熒光定量檢測技術(shù)，并對其應(yīng)用效果等進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法僅對SLCMV DNA樣品產(chǎn)生特異性熒光信號，對陽性質(zhì)粒標準品的最低檢出量為4.5×10¹ copies/μL。標準曲線顯示，C_t值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈良好線性關(guān)系，曲線斜率為-3.1312，相關(guān)系數(shù)（R²）為0.9969，擴增效率（E）為97.9%，標準曲線方程為y=-3.1312x+34.599。利用該技術(shù)對廣西和福建的2個木薯種植園供試樣品進行檢測，葉片陽性檢出率分別達95.45%和78.57%，最低檢測拷貝數(shù)為1.45×10⁵copies/g，而田間煙粉虱攜毒率為86%，最低帶毒量為9.42×10⁴ copies/頭。該技術(shù)具有良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，可為該病的田間鑒定、早期診斷、無毒種莖評價等監(jiān)控工作提供有效的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：木薯；斯里蘭卡木薯花葉病毒；TaqMan熒光定量PCR中圖分類號：S435.33 """""文獻標志碼：A

Establishment and Application of TaqMan Fluorescence Quantitative PCR （TaqMan qPCR） Detection Method of Sri Lankan Cassava Mosaic Virus

HUANG Jingshan^1，2， WANG Guofen²， SHI Tao²， LI Chaoping²， CHEN Yipeng²， CAI Jimiao²， LI Boxun²， LIU Xianbao²， HUANG Guixiu^2，3*

1. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haokou， Hainan 571101， China; 3. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Tropical Crop Breeding， Sanya， Hainan 572024， China

Abstract： Sri Lankan cassava mosaic disease， caused by Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）， is a recently emerging dangerous disease in China. Existing detection methods of SLCMV are constrained by low sensitivity and poor efficiency， impeding related research and applications. Primers and probes were designed according to the gene sequences of the SLCMV， and a positive plasmid standard was prepared. The TaqMan fluorescence quantitative detection technology for SLCMV was established， and its application effect was verified. The method only generated specific fluorescence signals for SLCMV DNA samples， and the minimum detectable amount of the positive plasmid standard was 4.5×101 copies/μL. The standard curve showed that there was a good linear relationship between the C_t value and the logarithm of the copy number. The slope of the curve was –3.1312， the correlation coefficient R2 was 0.9969， the amplification efficiency （E） was 97.9%， and the equation of the standard curve was y=–3.1312x+34.599. Using this technology to detect the tested samples from two cassava plantations in Guangxi and Fujian， the positive detection rate of leaves was 95.45% and 78.57%， respectively， and the minimum detectable copy number was 1.45×10⁵copies/g. The virus-carrying rate of Bemisia tabaci in the field was 86%， and the minimum virus-carrying amount was 9.42×10⁴ copies/B. tabaci. This technology has good sensitivity， specificity， and repeatability， and could provide effective technical support for the monitoring and control work such as field identification， early diagnosis， and evaluation of virus-free stem cuttings of the disease.

Keywords： cassava; Sri Lankan cassava mosaic virus; TaqMan qPCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

木薯（Manihot esculenta）屬于大戟科木薯屬，原產(chǎn)于南美洲亞馬孫平原南部邊緣，目前在熱帶和部分亞熱帶地區(qū)廣泛種植。木薯塊根肉質(zhì)，富含淀粉，被譽為“淀粉之王”“地下糧倉”，與馬鈴薯、甘薯并稱為世界三大薯類，也是全球第六大糧食作物。木薯在我國華南地區(qū)廣泛種植，鮮薯收獲后，除少量直接鮮食或飼用外，主要用作工業(yè)原料，可加工出多達3000種產(chǎn)品，覆蓋人民生活的各個領(lǐng)域^[1]。目前，廣西是國內(nèi)木薯最大的種植區(qū)域，海南、廣東等地區(qū)也是重要的種植區(qū)^[2]。

斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）屬于雙生病毒科（Gemini-vieidae）菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus），是已知11種木薯花葉雙生病毒（Cassava Mosaic geminiviruses， CMGs）中的一種。SLCMV侵染后，首先在發(fā)病葉片部分部位出現(xiàn)褪綠、黃化，隨后擴大且出現(xiàn)類似“花葉”的癥狀，典型癥狀為葉片黃化、皺縮畸形及斑駁等癥狀。SLCMV主要通過帶毒種莖進行遠距離傳播^[3]，田間條件下主要通過煙粉虱進行短距離擴散^[4]。該病毒引起的斯里蘭卡木薯花葉病毒病（Sri Lankan cassava mosaic disease，SLCMD）是亞洲地區(qū)重要的木薯病害，近年來在東南亞地區(qū)的木薯園內(nèi)發(fā)生嚴重為害^[5]。2018年，本團隊首次在海南儋州和澄邁發(fā)現(xiàn)該病害^[6]，隨后調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病在主要種植區(qū)均有零星發(fā)生，已經(jīng)成為國內(nèi)木薯種植業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的潛在威脅。

SLCMV的早期檢測對于病害的田間防控工作具有重要的指導(dǎo)意義。王國芬等^[7]初步建立了SLCMV的常規(guī)檢測技術(shù)，周司珊^[8]進一步開展了巢式PCR檢測技術(shù)的研究和應(yīng)用工作。AYAKA等^[9]、ARUTSELVAN等^[10]先后開展了SLCMV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amp-liffcation，LAMP）檢測技術(shù)研究，并獲得靈敏度比常規(guī)方法高100倍的效果。SLCMD為我國木薯新發(fā)病害，常規(guī)PCR和巢式PCR檢測方法存在靈敏度低、效率不高等不足，而LAMP技術(shù)常獲得假陽性結(jié)果^[10]，對于新發(fā)病害并不適用。因此，本研究基于SLCMV外殼蛋白AV1基因保守序列，設(shè)計引物和探針，開展TaqMan熒光定量PCR（TaqMan qPCR）檢測技術(shù)的研發(fā)工作，旨在為該病害的早期診斷和有效防控提供技術(shù)支持。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 樣品采集 "木薯葉片樣品由本團隊于2024年分別在廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣和福建省大田縣發(fā)病木薯園內(nèi)，采集出現(xiàn)異常褪綠、花葉等癥狀的SLCMD疑似病葉，同時在附近無病薯園內(nèi)收集無病葉片。煙粉虱（Bemisia tabaci）樣品于2024年采集于廣西壯族自治區(qū)北海市鐵山港區(qū)發(fā)病薯園。木薯無病葉片基因組DNA、木薯普通花葉病毒（Cassava common mosaic virus， CsCMV）cDNA、木薯細菌性萎蔫病菌（cassava bacterial blight，CBB）基因組DNA、SLCMV重組質(zhì)粒標準品（載體為pMD 18-T vector，克隆有該病毒外殼蛋白AV1編碼序列，GenBank登錄號為WCR23751）等均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.1.2" 主要試劑與儀器" Ex Taq酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、pMD 18-T Vector、質(zhì)粒提取試劑盒、實時熒光定量PCR（探針法）試劑盒等分別購自寶生物工程（大連）有限公司和天根生化科技（北京）有限公司；熒光探針、引物由深圳華大基因科技有限公司合成。所用主要儀器為qTower 3G實時熒光定量PCR儀，購自德國椰拿分析儀器有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 樣品總DNA提取" 參考王國芬等^[7]和何海芳^[11]的方法，分別提取木薯葉片、單頭煙粉虱

總DNA，方法略有改進，每0.1"g葉片及每頭煙粉虱的DNA樣品分別用50 μL和30 μL去離子水進行溶解。

1.2.2" 引物與探針設(shè)計與合成 "參照周司珊^[8]的方法，合成引物對SL12/SL13和CP1F/CP1R（表1）進行樣品的巢式PCR檢測?；赟LCMV外殼蛋白AV1基因保守序列，設(shè)計特異性引物SLCMV-QF638/SLCMV-QR699和探針Probe-661（表1），用于TaqMan qPCR研究。

1.2.3" TaqMan qPCR引物驗證" 隨機選取2份SLCMD陽性樣品和2份無病木薯樣品DNA（陰性對照），以ddH₂O為空白對照，參照林兆威等^[12]的方法，用SLCMV-QF638/SLCMV-QR699引物對和探針Probe- 661進行TaqMan qPCR。

1.2.4 "陽性質(zhì)粒標準品的制備及靈敏度、特異性與重復(fù)性驗證 "參考林兆威等^[12]的方法進行陽性質(zhì)粒標準品的制備。以感染斯里蘭卡木薯花葉病毒?。⊿LCMV）的木薯葉片DNA為陽性對照，以木薯無病葉片基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA、木薯細菌性萎蔫病菌基因組DNA、無菌水等為陰性對照進行特異性試驗。以不同濃度梯度的的陽性質(zhì)粒標準品為模板進行靈敏度和重復(fù)性驗證。各處理重復(fù)3次。

1.2.5" 田間樣本檢測 選取分別來自廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣和福建省大田縣發(fā)病木薯園的疑似SLCMD樣品，以及來自北海市鐵山港區(qū)的煙粉虱樣品，分別進行巢式PCR和TaqMan qPCR檢測，并計算其拷貝數(shù)區(qū)間。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 熒光定量PCR引物驗證

隨機選取2份具有SLCMD典型癥狀陽性樣品和2份無病陰性樣品的基因組為模板，以ddH₂O為空白對照，利用引物SLCMV-QF638/SLCMV- QR699和探針Probe-661進行TaqMan qPCR擴增。陰性樣品和空白對照未產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，呈一條直線，而2份陽性樣品的擴增產(chǎn)物濃度均出現(xiàn)指數(shù)增長，表現(xiàn)為“S”形擴增曲線。試驗結(jié)果表明所設(shè)計的引物/探針組合能有效檢測到SLCMV，可進行進一步研究（圖1）。

2.2" 靈敏度試驗與標準曲線的建立

SLCMV重組質(zhì)粒提取后，用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計測其質(zhì)量濃度為38.5"ng/μL，A_260/280比值為1.79，換算成拷貝數(shù)為4.5×10¹⁰ copies/μL。以陽性質(zhì)粒標準品4.5×10⁹～4.5×10⁰ copies/μL等10個濃度梯度為模板，無病木薯樣品為陰性對照，用本研究設(shè)計的引物對和探針進行TaqMan qPCR。當質(zhì)粒濃度在4.5×10¹ copies/μL以上時，該反應(yīng)體系均可檢出（圖2）。標準曲線表明C_t值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，斜率為?3.1312，相關(guān)系數(shù)（R²）為0.9969，擴增效率（E）為97.9%，其標準曲線方程為y=?3.1312x+ 34.599（圖3）。

2.3" 特異性試驗

以無菌水為空白對照（blank control，BC），

無病葉片（disease-free leaves，DFL）的基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA和木薯細菌性萎蔫病菌基因組DNA等為陰性對照進行SLCMV的TaqMan qPCR檢測。結(jié)果僅SLCMV出現(xiàn)擴增曲線，空白對照、木薯無病葉片的基因組DNA、木薯普通花葉病毒cDNA、木薯細菌性萎蔫病菌基因組DNA等樣品均未獲得擴增產(chǎn)物（圖4），表明該方法對SLCMV的檢測效果具有良好的特異性，無病木薯組織及2種常見病害均不會對本檢測方法產(chǎn)生非特異性干擾。

2.4" 重復(fù)性驗證

分別制備濃度為4.5×10⁶、4.5×10⁷、4.5×10⁸、4.5×10⁹ copies/μL的陽性質(zhì)粒標準品，以其為模板進行TaqMan qPCR的組內(nèi)、組間的重復(fù)性和穩(wěn)定性評價。組內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果表明，C_t值的變異系數(shù)為0.53%～0.84%。以相同的試驗條件，對每個稀釋濃度分別進行3次獨立的重復(fù)性試驗，結(jié)果表明C_t值的變異系數(shù)為0.67%～1.58%。組內(nèi)變異系數(shù)小于1%，而組間變異系數(shù)小于2%，表明建立的TaqMan qPCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好（表2）。

2.5" 田間樣本檢測

隨機選取分別來自廣西合浦和福建大田的病樣，利用本試驗建立的TaqMan qPCR和巢式PCR技術(shù)分別進行檢測。巢式PCR檢測結(jié)果顯示，廣西合浦田間22份樣品中有7份為陽性，而TaqMan qPCR檢測出21份陽性。福建大田樣品用巢式PCR檢測出11份為陽性，而TaqMan qPCR檢測出14份陽性。相關(guān)結(jié)果表明，TaqMan qPCR檢出率顯著高于巢式PCR技術(shù)，這與該方法靈敏度更高一致。計算其最低和最高拷貝數(shù)，得出其陽性的病毒拷貝數(shù)，合浦地區(qū)木薯樣品病毒拷貝數(shù)在1.43×10⁵～4.09×10¹¹ copies/g之間，而福建大田木薯樣品病毒拷貝數(shù)在6.70×10⁵～1.88× 10⁹ copies/g之間（表3）。

在廣西北海鐵山港區(qū)發(fā)病木薯園隨機選擇14株受害植株，各抓取1頭煙粉虱，提取基因組DNA后應(yīng)用TaqMan qPCR方法對營盤鎮(zhèn)田間疑似SLCMV感染的木薯煙粉虱種群進行單頭定量檢測。結(jié)果表明，12頭煙粉虱攜帶有SLCMV，比例為85.71%，其C_t值均低于23.65，而單頭煙粉虱攜帶病毒數(shù)量在9.42×10⁴～2.33×10⁹ copies/頭之間（表4）。

3" 討論

在植物病毒快速檢測方法研發(fā)中，靈敏度和特異性是主要考慮的因素。TaqMan qPCR具有很高的靈敏度，可檢測低至幾個拷貝的病毒核酸，尤其適用于早期感染或低濃度病原物的檢測。在甘薯雙生病毒^[13]、番茄褪綠病毒^[14]、香蕉線條病毒^[15]和柑橘褪綠矮縮病毒^[16]等的檢測中，TaqMan qPCR比常規(guī)PCR的靈敏度高100倍，同時對一些難于分離和核酸提取的微量病原物，如檳榔黃化植原體和檳榔隱癥病毒1型，具有明顯的優(yōu)勢^[12]。在特異性方面，TaqMan qPCR利用上下游引物和中間探針進行雙重驗證，使其特異性更強，有效避免非特異性擴增，減少了假陽性結(jié)果。探針法的優(yōu)勢還在于能對樣品進行定量和定性分析，通過標準曲線可精確計算病毒載量，為病害流行學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持。檢測過程完全封閉減少交叉污染，且后續(xù)無需處理，進一步提高檢測工作的效率。

在我國，木薯主要病害的早期侵染癥狀具有較高的相似性。木薯普通花葉病由木薯普通花葉病毒（屬于RNA病毒）侵染引起，受害葉片同樣形成和SLCMD相似的“花葉狀”^[7]，僅能通過分子檢測才能確認。細菌性萎蔫病是我國木薯種植中為害最嚴重的病害，發(fā)病葉片最初同樣出現(xiàn)相似的褪綠癥狀，只有癥狀充分形成后才能夠準確識別。因此，病害的早期診斷，一直是監(jiān)控工作中的難題。傳統(tǒng)的田間識別方法依賴典型癥狀的識別，往往延誤防控時機。此外，田間條件下，常存在多種病原的復(fù)合侵染現(xiàn)象，進一步增加了診斷難度。本研究建立的TaqMan qPCR技術(shù)針對木薯花葉病毒（SLCMV）的保守序列設(shè)計引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件（如退火溫度、引物濃度等），可實現(xiàn)對木薯組織、煙粉虱等的SLCMV精準檢測，且具有良好的特異性。另外，周司珊^[8]發(fā)現(xiàn)巢式PCR的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。與巢式PCR相比，本研究建立的TaqMan qPCR技術(shù)，靈敏度進一步提高了10倍，從而有助于實現(xiàn)病害的早期精準診斷，2種方法的田間檢測結(jié)果也證明了這一點。此外，本技術(shù)還實現(xiàn)了對病毒傳播媒介煙粉虱的攜毒檢測，從而能夠有效監(jiān)測田間帶毒介體數(shù)量，為該病害的早期預(yù)警和綜合防控提供技術(shù)支持。

4" 結(jié)論

SLCMD是國際木薯危險性病害，本研究成功建立一種基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法，用于檢測斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）。該方法具有高靈敏度、強特異性和良好的重復(fù)性，能夠有效檢測SLCMV的早期感染。和常規(guī)PCR相比，該方法檢測效率提高1000倍，也比巢式PCR高10倍。標準曲線顯示，C_t值與拷貝數(shù)的對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，擴增效率為97.9%，標準曲線方程為y=–3.1312x+34.599。特異性研究表明該方法僅能針對SLCMV進行有效擴增，無病葉片、木薯普通花葉病等病原均不能獲得擴增產(chǎn)物。田間應(yīng)用表明，該方法可有效提高病毒樣品的檢出率，能夠為該病的田間鑒定、早期診斷、無毒種莖評價等監(jiān)控工作提供有效的技術(shù)支持，有望在該病田間監(jiān)控工作中發(fā)揮重要作用。

參考文獻

[1]"""""" 古碧， 李開綿， 張振文， 謝彩鋒， 李凱. 我國木薯加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)（農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)）， 2013， 11： 25-31.GU B， LI K M， ZHANG Z W， XIE C F， LI K. Current development status and future trends of cassava processing industry in China[J]. Agricultural Engineering Technology （Agricultural Product Processing Industry）， 2013， 11： 25-31. （in Chinese）

[2]"""""" 楊梅瓊. 廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢與對策建議[J]. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用， 2020， 33（6）： 74-77.YANG M Q. Development situation of Guangxi’s cassava industry and its counter measures[J]. Journal of Agricultural Research and Application， 2020， 33（6）： 74-77. （in Chinese）

[3]"""""" MINATO N， SOK S， CHEN S， DELAQUIS E， PHIRUN I， LE V X， BURRA D D， NEWBY J C， WYCKHUYS K A G， DE H S. Surveillance for Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV） in Cambodia and Vietnam one year after its initial detection in a single plantation in 2015[J]. PLoS One， 2019， 14： e0212780.

[4]"""""" UKE A， HOAT T X， QUAN M V， UGAK LM， NATSUAKI K T. First report of Sri Lankan cassava mosaic virus infecting cassava in Vietnam[J]. Plant Disease， 2018， 102： 2669-2670.

[5]"""""" PADINJAREPULIKKIYIL S H， THULASI R R， MAD-HAVI N S， THANGARAJ M. Cassava mosaic disease in South and Southeast Asia： current status and prospects[J]. Frontiers， 2023， 27（6）： 10.3389.

[6]"""""" 時濤， 王國芬， 李超萍， 林兆威， 黃貴修. 木薯花葉病在中國發(fā)生的首次報道[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 38（10）： 99-100.SHI T， WANG G F， LI C P， LIN Z W， HUANG G X. First report of Sri Lankan cassava mosaic virus infected cassava in China[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2018， 38（10）： 99-100. （in Chinese）

[7]"""""" 王國芬， 李超萍， 時濤， 周司珊， 李博勛， 蔡吉苗， 林兆威， 黃貴修. 我國木薯花葉病毒病的發(fā)生危害及其病原鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2021， 42（6）： 1668-1677.WANG G F， LI C P， SHI T， ZHOU S S， LI B X， CAI J M， LIN Z W， HUANG G X. Distribution and pathogen detection of cassava mosaic virus disease in China[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2021， 42（6）： 1668-1677. （in Chinese）

[8]"""""" 周司珊. 國內(nèi)木薯花葉病毒病病原鑒定及其疫情監(jiān)測研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2021.ZHOU S S. Pathogen identification and the disease epidemic surveillance of cassava mosaic disease in China[D]. Haikou： Hainan University， 2021. （in Chinese）

[9]"""""" AYAKA U， SOPHARY K， KOHEI K， TAKUMA S， OK- KYUNG K， TRINH X H， KEIKO T N， MASASHI U. Detection of Sri Lankan cassava mosaic virus by loop-mediated isothermal ampliffcation using dried reagents[J]. Journal of Virological Methods， 2022， 299： 114336.

[10]""" ARUTSELVAN R， MAKESHKUMAR T. Single-tube colorimetric loop-mediated isothermal ampliffcation （LAMP） assay for high-sensitivity detection of SLCMV in cassava from southern India[J]. Microbial Pathogenesis， 2024， 192： 106718.

[11]""" 何海芳. 瓜類褪綠黃化病毒與介體煙粉虱互作關(guān)系研究[D]. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2023.HE H F. The interactions of CCYV with its vector Bemisia Tabaci[D]. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2023. （in Chinese）

[12]""" 林兆威， 牛曉慶， 唐慶華， 宋薇薇， 孟秀利， 覃偉權(quán). 檳榔隱癥病毒1型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2021， 42（11）： 3087-3092.LIN Z W， NIU X Q， TANG Q H， SONG W W， MENG X L， QIN W Q. Development of a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR method for detection of areca palm velarivirus 1[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2021， 42（11）： 3087-3092. （in Chinese）

[13]""" 田雨婷， 趙曉立， 喬奇， 王爽， 秦艷紅， 張德勝， 王永江， 張振臣. 甘薯雙生病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 江蘇師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 37（3）： 35-39.TIAN Y T， ZHAO X L， QIAO Q， WANG S， QIN Y H， ZHANG D S， WANG Y J， ZHANG Z C. Development and application of real-time fluorescent quantitative PCR method for detection of sweepoviruses[J]. Journal of Jiangsu Normal University （Natural Science Edition）， 2019， 37（3）： 35-39. （in Chinese）

[14]""" 王吉成， 李潔， 丁天波， 褚棟. 番茄褪綠病毒TaqMan熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 昆蟲學(xué)報， 2020， 63（2）： 159-165.WANG J C， LI J， DING T B， CHU D. Development and application of a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR method for rapid detection of Tomato chlorosis virus[J]. Acta Entomologica Sinica， 2020， 63（2）： 159-165. （in Chinese）

[15]""" 孫潔， 王婉， 饒雪琴， 李華平. 應(yīng)用TaqMan real-time PCR 研究BSV在帶毒香蕉組培苗中傳遞[J]. 植物病理學(xué)報， 2017， 47（2）： 187-196.SUN J， WANG W， RAO X Q， LI H P. Transmission of banana streak virus in virus-infected banana plantlets using TaqMan real-time PCR[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2017， 47（2）： 187-196. （in Chinese）

[16]""" 王瑛麗， 王琴， 劉瑩潔， 楊真， 李雪燕， 周彥. 柑橘褪綠矮縮病毒實時熒光定量PCR檢測體系的建立與應(yīng)用[J]. 植物保護學(xué)報， 2019， 46（4）： 931-932.WANG Y L， WANG Q， LIU Y J， YANG Z， LI X Y， ZHOU Y. Establishment and application of a quantitative PCR assay for the detection of Citrus chlorotic dwarf-asso-ciated virus[J]. Journal of Plant Protection， 2019， 46（4）： 931-932. （in Chinese）